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1、一 实验目的本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。二 实验原理植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物 中有a 淀粉酶及P 淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化， 其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。a 淀粉酶和0 淀粉酶都各有其一定的特性，如0 淀粉酶不耐热，在 高温下容易钝化，而a 淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶 提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝 化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70C维持15分钟以 钝化0 淀粉酶，便可测定a 淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.
2、6的醋酸 在0C加以处理，钝化a 淀粉酶，以测出0 淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5二硝基水杨酸试剂测定。由于麦 芽糖能将后者还原成 3氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色 的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽谈到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀 粉酶活性大小。三 实验材料萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右）四 实验仪器和试剂1仪器：电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管25mL （9 个）、10mL （1 个）、试管 6 支、移液管1mL （2 支）、2mL （2 支）、10mL （2支） 、离心机、恒温水浴锅、 72
3、20型分光光度计2试剂：1淀粉溶液、 0.4mol/LNaOH、pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL； B、 称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 OOOmL；取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。3,5 二硝基水杨酸：精确称取3,5 二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL， 盖紧瓶盖，勿让CO?进入。麦芽糖标准液:称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。五 操作步骤1酶液的提取：称取萌发
4、的水稻种子0.5g (芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀 浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分 钟振荡一次，放置 20 分钟后离心，取上清液备用。2a 淀粉酶活性的测定：( 1)取三支试管，编号注明1支为对照管， 2支为测试管。(2) 于每管中各加入酶提取液1mL，在70C恒温水浴中(水文的变化不应 该超过0.5C)，准确加热15分钟，在此期间P 淀粉酶受热钝化，取出后 迅速在自来水中冷却。(3) 在试管中各加入lmLpH5.6的柠檬酸缓冲液。(4) 向对照管中加入4mL0.4mol/LNa0H，摇动2 3分钟，静止2分钟，以 钝化酶的活性，再加入1
5、%淀粉2mL。(5) 将测定管置40C(0.5C )恒温水浴中保温15分钟，再加入40C下 预热的1%淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40C水浴中准确保温15min取出，迅 速加入4mL0.4mol/LNaOH，以终止酶的活动，然后准备下一步糖的测定。3. a 淀粉酶和B 淀粉酶总活性的测定：取上述酶提取液1mL，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至10mL (稀释程度视 酶活性的大小而定)。混合均匀后，取3 支试管， 1 支为对照管， 2 支为测定管， 各加入稀释的酶液1mL、pH5.6的柠檬酸缓冲液1mL。以上步骤重复a 淀粉酶 测定的第(4)及(5)的操作，同样准备糖的测定。4麦芽糖的测定：(1
6、) 标准曲线的制作：取25mL刻度试管5个编写号分别加入麦芽糖标准液(1mg/mL) 0.0、0.5、 1.0、1.5、2.0mL，然后于各管加入蒸馏水使溶液为2mL，再各加3,5-二硝基水 杨酸试剂2mL，置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。 用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录光密度，以光密度为纵 坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。(2) 样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1mL，分别加入25mL刻 度管中，再加入1mL的水，3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，混匀置沸水中准确煮5 分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm 的波长下进行比色，记录吸光度，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以 表示酶的活性。六 结果计算A： a -淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）Af a -淀粉酶对照管中麦芽糖量（mg）B： a +p -淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）B1： a +B -淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg）
