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1、人白细胞介素2 （IL-2）酶联免疫分析试剂盒使用说明书第一部分ELISA简介ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（Enzyme-LinkedlmmunosorbnentAssay的简称。自上世纪70年代初 问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗 原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或
2、抗体，也通过反应而结合在固相载体上 此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色 产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的 催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。第二部分ELISA的样本实验准备在收集样本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进 行检测的样本，及时储存在4c备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20r备用，有条件的， 最好-70C冻存备用。标本应避免反复冻融。液体类标本:包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、
3、细胞培养上清等。1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存 过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟 左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀 形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细
4、 收集上清。5. 培养细胞：检测细胞内的成份时，用PBS （）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反 复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000 转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。6. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS,。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍 然保持2-8C的温度。加入一定量的PBS （）,或组织蛋白萃取试剂，用手工或匀浆器将标本匀浆化。 离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。7. 标本采集后尽早进行提取，提取按相
5、关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20C保存，但应避免反复冻融 & 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。第三部分ELISA试剂盒的检测目的和实验原理1. 检测目的本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中白细胞介素2（IL-2）含量。2. 实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人白细胞介素2（IL-2）水平。用纯化的人白细胞介素2 （IL-2） 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白细胞介素2（IL-2），再与HRP标记 的白细胞介素2（IL-2）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗
6、涤后加底物TMB显色。 TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的白细胞 介素2（IL-2）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（0D值），通过标准曲线计算样品中人 白细胞介素2（IL-2）浓度。第四部分试剂盒组成试剂盒组成48T96T保存说明书1份1份封板膜2 片（48）2 片（96）密封袋1个1个酶标包被板1X481X962-8C保存标准品（2400pg/ml）X1瓶X1瓶2-8C保存标准品稀释液X1瓶X1瓶2-8C保存酶标试剂3mlX 1 瓶6ml X1 瓶2-8C保存样品稀释液3mlX 1 瓶6ml X1 瓶2-8C保存显色剂A液
7、3mlX 1 瓶6ml X1 瓶2-8C保存显色剂B液3mlX 1 瓶6ml X1 瓶2-8C保存终止液3mlX 1 瓶6ml X1 瓶2-8C保存浓缩洗涤液（20 倍）20mlX1 瓶（30 倍）20mlX1 瓶2-8C保存第五部分操作步骤1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。1200pg/ml5号标准品150 u l的原倍标准品加入150 u l标准品稀释液600pg/ml4号标准品150 ul的5号标准品加入150 u l标准品稀释液300pg/ml3号标准品150 ul的4号标准品加入150 u l标准品稀释液150pg/ml2号标准品1
8、50 ul的3号标准品加入150 u l标准品稀释液75pg/ml1号标准品150 ul的2号标准品加入150 u l标准品稀释液2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50卩1,待测样品孔中先加样品稀释液40卩1,然后再加待测样品10ul （样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3. 温育：用封板膜封板后置37C温育30分钟。4. 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此 重
9、复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50ul,空白孔除外。7. 温育：操作同 3。8. 洗涤：操作同 5。9. 显色：每孔先加入显色剂A50 ul,再加入显色剂B50ul,轻轻震荡混匀，37C避光显色15分钟.10. 终止：每孔加终止液50ul,终止反应（此时蓝色立转黄色）。11测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（0D值）。测定应在加终止液后15分钟以 内进行。12. 操作程序总结：第六部分计算以标准物的浓度为横坐标，0D值为纵坐标，在坐标 纸上绘出标准曲线，根据样品的0D值由标准曲线查 出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度 与0D值计算出标准曲线的直线回归
10、方程式,将样品 的0D值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释 倍数，即为样品的实际浓度。第七部分注意事项1试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板 条应装入密封袋中保存。2浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本）D值大于标准品 孔第一孔的0D值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（1倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（XnX5）o5封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物请避光保存。7严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9本试剂不同批号组分不得混用。第八部分检测范围40pg/ml-1200pg/ml第九部分保存条件及有效期1.试剂盒保存：-8C2有效期：6 个月
