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1、 梗阻性黄疸胆汁中胆管脱落细胞研究 作者：蔡磊 曲强 何小东 周立 张晋夏 【摘要】 目的 建立梗阻性黄疸患者胆管引流胆汁中脱落细胞收集方法，比较胆管良性病变及恶性肿瘤胆管脱落细胞特征。方法 从临床收集64例梗阻性黄疸患者引流胆汁，分离提取有核细胞，比较胆管结石和胆管癌病例胆管脱落细胞数量。涂片或应用瑞姬双染法染色后观察不同病例胆管脱落细胞形态。结果 梗阻性黄疸胆汁引流中可收集到大量胆管脱落细胞。胆管癌病例胆管脱落细胞数量显著多于胆管结石病例，分别为()103个/ml和()102个/ml(P 【关键词】 胆管脱落细胞； 胆管癌； 胆管结石； 梗阻性黄疸 【Abstract】 Objective
2、 To set up a method for collecting biliary cells in the bile drainage in patients with obstructive jaundice and compare the characteristics of cells between benign and malignant biliary cancer. Methods The bile drainages from 64 patients with obstructive jaundice were collected for extracting the bi
3、liary cells. Then, the cell number in the bile drainages from cholangiolithiasis was compared with that in the bile drainage from cholangiocarcinoma. The cell morphology was observed by cell smear or WrightGiemsas staining. Results A considerable number of biliary cells were collected from the bile
4、drainage. The cells in the bile drainage of patients with cholangiocarcinoma were ()103/ml, which was significantly more than ()102/ml in the bile drainage of those with cholangiolithiasis (P 【Key words】 Biliary cells; Cholangiocarcinoma; Cholangiolithiasis; Obstructive jaundice 梗阻性黄疸在外科临床上常见。胆管结石和胆
5、管癌是导致梗阻性黄疸的主要病因。经胆汁引流进行胆管脱落细胞的细胞学检查，是近年来逐渐开展的诊断技术。多种非手术获取细胞方法已被应用，如经PTCD、ERCP引流胆汁或同时采用细胞刷取、组织钳夹等技术1。但是，受胆汁引流量较少或操作技术限制，目前对病理状态下胆管脱落细胞数量和形态缺乏整体认识， 细胞学诊断鉴别良恶性病变敏感性和稳定性较差。本研究在改进胆汁收集方法基础上， 比较胆管结石和胆管癌胆汁中脱落细胞特征，为进一步认识胆管病变过程中胆管上皮细胞形态，在细胞和分子生物学水平研究胆管恶性肿瘤发生提供新思路。 1 材料与方法 一般资料 我院基本外科2017年10月至2017年6月收治梗阻性黄疸患者6
6、4例，男34例，女30例；中位年龄56岁(2982岁)。TB为63468 mol/L(正常范围 mol/L)。所有患者在手术前均行PTCD治疗，其中临床诊断为胆管下段癌晚期2例和胆管中段癌3例分别放置胆管支架姑息治疗，其余患者在TB降到15 mol/L以下后进行手术治疗。术后病理恶性病变31例(肝内胆管癌4例，肝门部胆管癌7例，中段胆管癌13例，下段胆管癌7例。其中肝内胆管中分化腺癌1例，肝内胆管低分化腺癌3例，肝门部中分化胆管癌2例，肝门部低分化胆管癌4例，肝门部未分化胆管癌1例，胆总管高中分化腺癌3例、胆总管中低分化腺癌7例、胆总管低分化腺癌8例，壶腹腺癌2例)，良性病变33例(肝内结石合
7、并胆总管结石10例，胆总管结石22例，胆总管损伤后狭窄1例)。 胆管脱落细胞的收集 收集梗阻性黄疸患者胆道引流6 h内的胆汁约200 ml，分别移至50 ml离心管(购自Corning公司)中，以1000 r/min离心20 min，弃上清后用40 ml PBS重悬，重复清洗胆汁45次。以Ficoll细胞分离液(购自Amersham公司)离心分离有核细胞，重悬后以细胞计数器计数细胞。 胆管脱落细胞的染色和观察 重悬细胞至1 ml PBS平衡液中，移至加有载玻片和滤纸的细胞沉淀仪内，4 冰箱过夜，自然干燥，用4 丙酮固定细胞10 min。瑞姬双染法进行染色：细胞固定好后加入瑞姬双染料混合物A液(
8、Baso公司)3滴，染色3 min，再加染料缓冲液B液6滴，充分混匀后，染色3 min，自来水冲洗玻片1 min，干燥后封片。涂片及染色后细胞在Nikon Eclips 80显微镜下观察，经Nikon CCD(DS5MU1)采集系统收集记录。 统计学分析 胆管癌和胆管结石胆汁中脱落细胞离心后分别计数，两组细胞数以s表示，组间均数比较采用ANOVA方法(SPSS 软件处理)。P 2 结果 良性或恶性胆管疾病所造成的梗阻性黄疸，胆道引流后每日收集胆汁引流量大致相同。观察胆汁形状发现胆管癌患者胆汁较稀薄，离心后涂片在光学显微镜下可见胆汁中脱落细胞数量多，呈聚集巢状，形态不规则(图1A)。胆管结石患者
9、胆汁多较黏稠，虽经反复清洗，涂片中仍有较多沉渣；镜下观察可见胆汁中脱落细胞形态规整均一，呈离散状(图1B)。细胞学检查结果与手术中切除标本病理诊断符合率为100%。在同等量胆汁中，胆管癌胆汁中脱落细胞计数明显多于胆管结石胆汁中脱落细胞，分别为()103个/ml和()102个/ml，差异有统计学意义(P 瑞姬双染法染色显示胆管癌胆汁中脱落细胞呈嗜碱性，体积大，成团聚集，视野中可见大量异形细胞。核质比失调，细胞核呈浓染，核质染色不均伴有核内空泡形成，核仁肥大且数量多少不等，核膜增厚明显，具有癌细胞特征(图1C)。胆管结石胆汁中脱落细胞体积较小，染色呈嗜酸性，核质比正常，细胞核着色均一，未见异常分裂
10、象，与胆管癌的脱落细胞形态结构明显不同(图1D)。 3 讨论 胆管癌是起源于胆管上皮的恶性肿瘤，确诊时多为晚期，手术切除率低，预后差。目前胆管癌的病因尚未明确，已经发现的胆管癌致病危险因素包括原发性硬化性胆管炎、肝血吸虫病、先天性胆管囊肿、肝内胆管结石、胆管损伤和丙型肝炎等。 Yeh等2发现胆管腔内胆管癌的形成可能经历下列阶段，即肝内胆管结石、胆管上皮细胞不典型增生和原位或微小浸润癌。因此，胆管结石或慢性炎症所导致的胆管上皮不典型增生可能是胆管癌的癌前病变。但是，由于胆管在体内的解剖位置特殊，目前研究多取自手术切除标本。如能在术前获取胆管上皮细胞，不但有助于胆管疾病的诊断和鉴别，更对胆管恶性肿
11、瘤发生、发展的动态检测，以及在细胞和分子生物学水平上深入认识胆管癌病因具有重要意义。 胆管脱落细胞检查是临床胆管梗阻病因诊断和鉴别诊断的重要方法，胆汁可经PTCD、ERCP和T管引流等途径取得。但是，以往应用此方法进行细胞学定性检查时，发现胆管癌诊断敏感性低，仅为%3。采用细胞刷直接刷取胆道的病变处，可获得较多有代表性的细胞，提高诊断敏感性。文献报道其敏感性为68%4，但仍存在相当高的假阴性。国内报道认为造成上述细胞学敏感性或稳定性较低的原因主要是病变胆道局部因素，如胆道肿瘤被纤维组织增生包埋而脱落不足、肿瘤细胞分化较好不易被辨认等。我们认为标本采集量不足也是结果不稳定的重要原因。以往胆汁采集
12、量多为35 ml，最多者2050 ml，其中胆管脱落细胞数量不均一。我们首先扩大胆汁采集量，并在改进采集方法后发现，胆管癌胆汁中存在大量的肿瘤脱落细胞，每100 ml中细胞数可达105个，而且细胞无坏死，镜下视野中绝大部分细胞形态符合肿瘤细胞特征。良性病变胆管结石的引流胆汁中亦有较多脱落上皮细胞。这些细胞形态均一，染色具有一般上皮细胞特点，镜下较少找到异形性细胞。细胞学观察与切除组织病理结果完全符合。肿瘤患者胆汁中脱落细胞数量普遍大于胆管结石患者引流胆汁中脱落细胞(P200 ml，因此克服了以往由于样本量少造成的敏感性和稳定性差的缺点。 近年来的蛋白和基因表达研究显示，部分生理情况下不表达或极少表达于胆管上皮的基因和相应蛋白，如黏蛋白、三叶肽和同源异型框蛋白等，在结石1 / 1
