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1、 脂肪源干细胞修复兔膝关节全层软骨缺损研究 【摘要】 观察评价兔膝关节髌股关节面中心人工制造全层关节软骨缺损后，单纯脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶移植到软骨缺损处对关节全层软骨缺损的修复效果，以探索关节软骨缺损修复简单有效的途径。方法新西兰大白兔27只随机分为A、B、C三组，A组关节软骨缺损处置入海藻酸钙凝胶，B组软骨缺损处不做任何处理，C组缺损处置入未经诱导的脂肪源干细胞复合海藻酸钙凝胶，分别于术后第4、8、12周处死动物，通过大体、组织切片观察以及透射电镜等技术手段对修复效果进行观测，采用改良的Wakitani评分标准对修复组织进行评分，所得评分采用统计软件SPSS 进行统计学分析。结果A、
2、B组软骨缺损处为纤维组织状物填充，组织学切片可见为原纤维覆盖，C组软骨缺损处为类透明软骨组织填充，组织切片可见类软骨细胞及其周围的陷窝，电镜下可见细胞周围大量胶原纤维，C组在各个时期与A组、B组的评分比较差异都具有统计学意义(P 【关键词】 脂肪源干细胞 海藻酸钙 软骨 Abstract: ObjectiveTo evaluate the effect of not induced adipose derived stem cells(ADSCs)with calcium alginate healing full-thickness cartilage defects of rabbit k
3、nee after the model was made in center of femoral facies patellaris artificially, in order to find a simple and working way of articular cartilage defect restoration. MethodTwenty-seven New Zealand white rabbits were divided in to A, B, C groups randomly. Calcium alginate was transplanted to cartila
4、ge defect position of rabbits of group A, nothing for group B and calcium alginate with not induced ADSCs for group C. The animals were killed in 4th, 8th and 12th week tissue was evaluated using naked eyes, histological section and transmission electron microscopy, score was given according to modi
5、fied Wakitani grade standard. The total score was analyzed with statistic software SPSS ResultArticular cartilage defects of the animal of groups A and B were filled with fibrous tissue which contains protofiber when it was checked using histological section and defect was filed with chondrocyte-lik
6、e tissue .Chondrocyte-like cells surrounded with lacunes were observed in histological section. Plenty of collagen fibers around cells could be seen under transmission electron microscopy. Group C had a significant statistical difference compared with groups A and B (P Key words：ADSCs; calcium algin
7、ate; cartilage 关节软骨的自身修复能力有限，其损伤后的修复一直是骨科界的难题之一。随着干细胞培养技术和组织工程技术的不断进步，多种组织工程方法被应用来探索软骨缺损治疗的可行性。2001年Zuk PA和Zhu Min1等从人脂肪组织悬液中第一次分离获得了多向分化干细胞。目前已证实脂肪组织来源干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）能向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞及心肌细胞定向诱导分化2。本实验将单纯脂肪源干细胞复合藻酸钙凝胶载体填充修复兔膝关节全层软骨缺损，对实验结果进行观察分析，以探讨单纯脂肪源干细胞应用于关节软骨缺损修复的可行性，为关
8、节软骨缺损修复探索简单有效的途径。 1 材料和方法 实验材料 主要仪器 (1)超净工作台(JHT-DDC型，济南康宝净化设备有限公司)；(2)恒温孵育箱(Heraeus公司，德国)；(3)倒置相差显微镜(Nikon TE2000，日本)；(4)50 ml培养瓶(Corning公司，美国)；（5）低温高速离心机（Heraeus公司，德国）。 主要试剂 (1)DMEM培养基(Gibco公司，美国)；(2) 型胶原酶(Sigma公司，美国)；(3)胰蛋白酶(上海华美公司，中国)；(4)胎牛血清(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)；(5)D-Hanks平衡盐（Sigma公司，美国）；（6）海藻酸钠（上
9、海化学试剂站分装厂）；（7）氯化钙（上海生工生物工程有限公司）。 2 实验方法 脂肪源干细胞的获取、培养和鉴定 将新西兰大白兔致死，无菌取双侧髂窝处脂肪组织约10 ml，用2倍体积D-Hanks平衡盐液漂洗3遍，剪成1 mm1 mm1 mm大小，加入%型胶原酶5 ml置于37温箱内消化 h，低温高速离心机内1 000 r/min离心10 min弃上清，加入160 mmol/L NH4Cl约5 ml裂解红细胞10 min，筛网过滤，按8 000个/cm2种植于50 ml培养瓶中。培养瓶置于37体积分数为5%的CO2恒温孵育箱内。24 h后首次换液，去除残余红细胞及未贴壁细胞，后每隔23 d换液一
10、次，融合达80%以上时传代，动物实验用细胞传至第4代。取部分2代细胞采用含10%FBS， mol/L地塞米松，50 mol/L维生素C，10 mmol/L -甘油磷酸钠，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素的DMEM诱导培养基向成骨细胞方向诱导。 动物实验 选择健康成年新西兰大白兔27只（购自山东鲁抗实验动物中心），体重 kg，雌雄不限。编号后随机分成A、B、C 3组，每组9只，双膝均用于实验。10%水合氯醛耳缘静脉麻醉，取双侧膝关节内侧切口，将髌骨推向外侧，进入关节腔。分别于左右两侧用直径 mm的钻头在髌股关节面中心造成全厚关节软骨缺损，深度以点状出血为止，约 mm。A组：（18膝
11、）缺损处单纯置入海藻酸钙凝胶。B组：（18膝），空白对照，缺损处不作任何处理。C组：（18膝），置入培养的脂肪源干细胞海藻酸钙凝胶复合物，细胞最终浓度不低于106 ml。术毕兔清醒后，放置笼内自由活动，青霉素肌注连续5 d。 检测方法 细胞学检测 生物学特性观察：观察细胞生长情况；取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色；另取部分向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色观察矿化结节，以证实所培养细胞有无干细胞特性。 修复组织检测 分别于术后4、8、12周处死动物，取材行大体、光镜组织学检查及电子显微镜下观察。(1)大体观察：膝关节滑膜有无充血水肿，关节囊有无粘连及修复组织
12、的平整度、光泽度；(2)组织学检测：将标本脱钙、梯度酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，HE染色和甲苯胺兰染色，进行光镜下组织学观察；（3）透射电镜观察：取12周修复组织，包埋后超薄切片，观察细胞及基质情况。 统计学分析 根据改良的Wakitani评分标准(见表1)采用盲法对各标本进行组织学评分。每一标本均有3人进行评分，取均数，所得评分结果应用SPSS 统计软件进行多因素方差分析，与对照组比较采用Dunnett检验。表1 软骨缺损修复的组织学评分标准指标组织学表现评分 3 结果 脂肪源干细胞培养及诱导 细胞于接种后24 h左右开始贴壁，细胞形态呈长梭形、三角形或多角形（图1）。细胞生长旺盛，34
13、d即可传代。取部分2代细胞制成细胞爬片做油红O染色，苏木素复染细胞核，胞质未被油红O着色（图2），可见胞质中不含脂质，与脂肪谱系细胞无相关性。细胞培养7代后仍然增殖旺盛。向成骨细胞方向诱导的2代细胞制成细胞爬片做Von Kossa染色，可观察到形成的矿化结节有Ag+沉积而呈黑色（见图3），说明所培养的脂肪源干细胞有向成骨细胞分化的能力，有潜在的分化特性，具有干细胞特征。 大体观察 术后34 d动物轻度跛行，1周左右恢复正常。膝关节无红、肿、热等炎症现象。处死动物后见关节液清亮，关节囊无挛缩、粘连和新生物形成，滑膜无充血水肿，软骨无侵蚀，关节边缘无骨赘形成。 术后4周，A、B组缺损处修复组织基本
14、相同，缺损处未完全填充，修复组织为灰白色，基底部呈深红色，未见明显的炎性肉芽组织；C组缺损处亦未完全填充，但修复组织呈黄白色外观，表面粗糙；呈连绵的小丘状，与周围关节软骨分界清楚。 术后8周，A、B组缺损处修复组织仍基本相同，缺损处未完全填充，但较前为多，修复组织仍为灰白色，表面粗糙，C组缺损处未完全填充，修复组织亦较以前为多，淡黄白色，表面变的光滑，有一定弹性，与周围正常软骨分界仍能辨认。 术后第12周，A、B组缺损多完全填充，基本为纤维组织状物覆盖，表面与正常软骨齐平，深灰白色，质软，与周围正常软骨组织分界清楚，易剥离；C组缺损区修复组织色泽、质地同正常关节软骨，表面光滑，与周围软骨组织界面平齐并完全整合，结合紧密，不1 / 1
