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1、兔实验性肺栓塞后组织型纤溶酶原激活物抑制因子【摘要】 目的：研究兔实验性肺血栓栓塞后组织型纤溶酶原激活物抑制因子1(PAI-1)在肺动脉中表达的动态变化。方法：日本健康大耳白兔48只随机平均分为栓塞组和对照组，栓塞组利用自体血栓经股静脉输入建立PTE模型，对照组输入生理盐水。用免疫组织化学及Western blot方法检测对照组及栓塞后即刻、4、8和24 h栓塞部位肺动脉组织中PAI-1蛋白表达的水平。结果：PAI-1在栓塞后即刻及24 h均见明显表达，而在栓塞后4 h和8 h表达明显减少；Western blot检测PAI-1蛋白在栓塞后4 h开始降低，8 h降低至低峰，与各对照组比较，差异
2、有统计学意义(P )。结论：兔急性肺栓塞后，机体抑制纤溶能力表现为一过性降低，说明在肺动脉栓塞后，特别是严重的大面积栓塞后，单纯依靠肺动脉局部的纤溶抑制系统平衡变化不能达到溶解全部栓子的目的，其原因可能与PAI-1表达呈一过性下降有关。【关键词】 肺栓塞；组织型纤溶酶原激活剂抑制物1；肺动脉；免疫组织化学 SABC法；兔 Abstract Objective: To investigate the changes in plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) expression in pulmonary artery after acute pulm
3、onary thromboembolism. Methods: Rabbit acute pulmonary thromboembolism models by injecting auto-blood clots into femoral vein were used to observe the protein expression of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) in pulmonary artery. Control group received injection of the same volume saline. Speci
4、mens were obtained from both normal and morbid pulmonary artery 0、4、8 and 24 hours after PTE, and the expression of plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) was measured by immunohistochemistry and Western blot. Results: Immunohistochemical SABC method revealed PAI-1 staining in the endothelial cell
5、s of the morbid pulmonary artery 0 and 24 h after PTE but few in morbid pulmonary artery 4h and 8h after PTE. The staining data supported by Western blot data showed that the expression of the PAI-1 diminished progressively at 4 h and 8h after PTE(). Conclusion： The study shows that the fibrinolysis
6、 inhibitory activity is decreased transiently after pulmonary thromnoembolism in rabbit, which indicate that it is not enough to dissolve the embolus just by the local fibrinolysis activity of pulmonary artery. Key words Pulmonary thromboembolism; Plasminogen activator inhibitor-1; Pulmonary artery;
7、 Immunohistochemical SABC method; Rabbit 组织型纤溶酶原激活剂已经作为治疗肺栓塞一种安全有效的药物而广泛用于临床治疗1。纤溶酶原激活剂抑制因子-1是体内t-PA的主要抑制剂，国外研究表明肺栓塞患者PAI-1血浆水平都明显升高，提示PAI-1与栓塞性疾病发病密切相关，但PAI-1蛋白水平表达的动态观察目前还未见报道。本实验通过建立急性兔肺栓塞模型，利用免疫组织化学及Western blot方法观察栓塞肺动脉管壁PAI1蛋白表达水平的动态变化。探讨急性肺栓塞后肺血管局部纤溶抑制功能的动态变化，了解急性肺栓塞后机体纤溶能力的变化，为临床肺血栓栓塞溶栓治疗及治疗
8、时机提供理论依据。 1 材料和方法 11 主要试剂 兔抗鼠PAI-1多克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG、IgG/HRP羊抗兔为武汉博士德生物工程有限公司产品。ECL显色试剂盒购自北京普利莱生物工程技术有限公司，Cruz-Marker。小鼠抗大鼠(-actin单克隆抗体为Sigma公司产品，IgG/HRP羊抗大鼠购自北京中山生物工程公司。 12 兔急性肺栓塞模型的建立 家兔予3%异戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后耳缘静脉采血1 ml。凝固45 min后做成35 mm长的的栓子置于10 ml生理盐水，于股静脉留置针输入，并于5 ml生理盐水冲洗静脉留置针；对照组输入15 ml生理盐水。标本采集：分别
9、于栓塞后即刻，4、8、24 h处死各栓塞组模型，观察大体标本有无梗死，结扎肺动脉根部,沿肺动脉走行解剖分离双测肺动脉，取出肺动脉,生理盐水冲洗,一侧肺动脉10的中性甲醛固定24 h，取栓塞明显的肺动脉石蜡包埋备用。一侧低温带回实验室，保存与80 冰箱中备用。同时留少许肺组织行HE染色病理学观察。 13 免疫组化检测PAI-1(SABC法) 石蜡包埋的组织标本4 m连续切片，常规脱腊至水，3双氧水阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，微波抗原修复后PBS洗涤。滴加5BSA封闭液，室温20 min后与PAI-1兔抗鼠多克隆抗体孵育4 过夜，再以PBS洗涤3次，滴加生物素化羊抗兔IgG室温30 min
10、后滴加试剂SABC，室温静置30 min，DBA显色，苏木素复染后封片。 14 Western blot法 将预冷至4 的细胞裂解液按61的比例与经PBS漂洗的栓塞肺动脉数段一起放入匀浆器内。在4 下充分匀浆离心后静置30 min取上清，并与等体积的2上样缓冲液混匀，100 加热35 min。采用Bradford法测定蛋白浓度。以80 g/泳道加样，10SDS-PAGE凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白转移至PVDF膜。将膜依次经10脱脂奶粉室温孵育45 min，PAI-1多克隆抗体4 孵育过夜和IgG/HRP第二抗体室温孵育2 h，每次孵育后用TTBS溶液洗膜3次，然后用ECL化学发光剂进行检
11、测。 15 统计学方法 采用统计软件进行分析,变量以xs表示,组间比较采用t检验,组内比较采用方差分析。为差异有统计学意义。 2 结 果兔实验性肺栓塞后病理改变 大体标本观察：实验动物肺表面有点片状出血灶，病变呈双侧分布，上段肺轻于下段肺。结扎肺动脉根部，沿肺动脉行走方向向远段解剖，肉眼可见栓塞部位的肺动脉血管充盈饱满，可探及血管内栓子。栓子栓塞的部位不定，但主要在亚段以上肺动脉。光镜观察各栓塞组肺动脉内可见注入的自体血栓，4 h栓塞组肺血管内皮细胞脱落明显,8 h肺泡周围及血管内大量炎性细胞浸润，24 h栓塞组栓塞周围有混合血栓形成。免疫组织化学 光镜下见PAI-1的阳性细胞为胞浆棕染,主要
12、在肺血管内皮细胞中；PAI-1在栓塞后即刻及24 h可见明显的细胞内胞浆棕染的阳性细胞，栓塞后4 h和8 h阳性细胞有所减少，正常对照组各时间点表达明显。Western blot检测 PAI-1的表达结果：各标本-actin产物表达量相近。PAI-1在栓塞后4 h和8 h表达逐渐下降，与栓塞后即刻相比差异明显，栓塞后24 h其表达有所升高，与栓塞后即刻相比差异无统计学意义。 3 讨 论 肺栓塞模型的制备 为了更能模拟人体下肢静脉血栓脱落导致急性肺栓塞的形成过程，我们采用自股静脉注入自体血栓的方法来制备兔的实验型急性肺栓塞模型。为了证实注入的栓子是否进入肺动脉，我们在实验的不同时间点处死部分动物
13、，观察肺组织大体情况，沿肺动脉行走方向解剖肺血管，最后行肺组织病理切片检查，均证实栓子存在于肺动脉血管中。本实验不同于其他PTE模型之处在于将血栓的大小及数目量化，使得栓塞严重程度尽可能相当且更易于复制，重复性和可操作性优于其他动物模型。PAI-1在栓塞肺动脉中的表达 PAI是机体主要的纤溶酶原抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员，分为4种，PAI-1、PAI-2、PAI-3和蛋白酶联结素，其中以PAI-1的作用最重要。它是一种分子量为54kD的糖蛋白，血浆中PAI-1主要由血管内皮细胞合成，在血浆、血小板、内皮细胞、成纤维细胞和肝细胞中均存在。PAI-1是t-PA的主要生理抑制剂，血浆
14、PAI-1通过t-PA/PAI-1的相互作用调节整个纤溶过程。PAI-1与释放入血循环的t-PA快速结合形成可逆性复合物，特异性地抑制t-PA，在纤溶系统中起调节作用，PAI-1水平增高使纤溶功能降低。全血PAI-1的3/4储存在血小板中，当血小板活化释放时，PAI-1被释放到血液中，抑制纤溶酶原激活物的活性，正常状态下，血浆中有活性的PAI-1只占3%5，大部分以无活性的形式存在。临床及基础研究表明，PAI-1与栓塞性疾病发病密切相关，Nicholls等研究发现，PAI-1与动脉栓塞性疾病发病呈正相关，其在血浆中的表达水平直接影响溶栓治疗的效果。Rosenhek等发现t-PA、PAI-1在肺
15、栓塞致死的患者肺动脉中表达均明显升高，但t-PA/PAI-1比值水平与在其他同口径的胸腔内动脉表达有所下降。说明机体在栓塞后其肺动脉的局部纤溶能力降低。Vappu等在实验性血管嫁接并发血栓的动物模型身上发现，在栓塞较为明显的部位血管内皮细胞PAI -1表达较高，而在栓塞轻微或栓塞发生再通的血管中PAI-1表达不明显。说明PAI -1升高与栓塞危险程度呈正相关。 本实验中的免疫组化检测结果显示，正常的兔肺动脉内膜完整，PAI-1在栓塞前及栓塞后24 h可见明显的细胞内胞浆棕染的阳性细胞，栓塞4 h和8 h阳性细胞明显减少，正常对照组各时间点表达明显。说明在肺栓塞早期阶段，与血栓接触明显的部位，主
16、要是血栓部位的血管内皮细胞，PAI-1的表达被诱导降低，局部抑制纤溶功能的能力下降，纤溶能力相对性地被提高，这种状态可能对血栓降解有利。 本实验的Western blot检测显示，PAI-1在正常肺动脉中已有表达，在栓塞4 h后，其表达水平有所下降，与正常对照组相比差异明显，这种状态持续到栓塞8 h后。我们认为有以下三种可能：本实验的对象为健康兔，其栓塞为纯外源性干预所致，其实验对象本身栓塞易感性并不高；PAI-1合成场所主要在肺血管内皮细胞，而在栓塞早期这些部位缺氧及直接的机械受损最为严重，病理观察可见这段时间血管内皮细胞受损脱落，中性粒细胞浸润，这些部位合成PAI-1的能力下降；机体通过应激机制调控PAI-1的表达，降低PAI-1分泌和活性，从而提高机体的纤溶能力，有利于机体的血栓溶解，而至栓塞后24 h，血管内混合血栓形成，血管内皮细胞产生PAI-1能力增强。 我们研究显示栓塞24 h后PAI
