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1、饲料中霉菌污染检测方法探讨文章来源：中国牧业网更新时间：2010-7-16点击数： 64评论本文饲料在加工、贮运过程中极易受霉菌污染，饲料一旦霉变，不仅其营养价值会降低，适口性会破坏，而且霉菌毒素会直接危害动物和人类的健康，甚至导致死亡，因此霉菌及霉菌毒素污染所造成的损失已引起人们的高度重视。霉菌(mould)不是一个分类学上的名称，而是某些丝状真菌的俗称，指在基质上长成具有绒毛状、棉絮状或蜘蛛网状的菌丝体的真菌，一般泛指毛霉、根霉、曲霉、青霉、镰刀菌等属真菌。近年来世界各国纷纷制订霉菌及霉菌毒素的限量标准，同时加强对霉菌检测技术的研究，并不断完善该项技术。我国在GB13078-91中公布了对
2、我国部分饲料原料中霉菌总数的允许量、限用量反禁用量，检测方法依照GB13092-91，但在实际检验工作中，发现了不少问题。饲料生态区系具有多样性和复杂性的特点，我国饲料中霉菌污染又比较普遍，因此对霉菌检测方法的研究具有重要的现实意义。本文根据检验中出现的问题，结合国内外有关研究的最新进展，对霉菌检测的接种方式、培养时间等问题作几点探讨。1 接种方式常用的微生物接种方式主要有倾注法和涂布法两种。目前国标方法中采用倾注法，然而有实验和报道证实，霉菌计数采用涂布法更合适。对霉菌计数来说，涂布法有以下几万面优越于倾注法：在操作上更容易：倾注法要求将培养基熔化之后凉至45再注入培养皿中，但实际上在稀释菌
3、液的同时，很难控制温度。如果培养基温度太高则可能使霉菌孢子受热损伤甚至死亡，同时如果样品已经稀释而培养基温度仍很高，则有可能使稀释液保持时间太长。如果温度太低时倾倒，培养基会凝固。如果在大批量进行检验时，则更难于掌握温度。涂布法培养所需的时间较短，培养出的霉菌菌落数较多，霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就受影响。由于涂布法是先倒好培养基，后接种，因而可以知道培养基是否染上杂菌。因此，霉菌计数采用涂布法既准确又省时。2 培养时间对饲料霉菌的检测时间，国标中采用培养3d后开始观察，应培养观察1周。我们发现，正常培
4、养条件下，许多样品在培养3d后已经无法准确计数，尤其是含有生长特别快、菌丝很多的菌如毛霉、根霉、木霉等样品和湿度较大的样品时，则必须提早观察记录，在48 h以内计数，否则菌丝就会覆盖整个平皿，无法准确计数。实验发现，培养34d的菌落数与57d的基本相同，因此，饲料中霉菌计数，培养2d就应开始观察，如果只是计数，培养24d已基本达到目的，但如果还要进一步分类鉴定，则需要培养更长的时间( 714 d)。3 培养基国标中霉菌检测使用的是高盐察氏培养基(CAO)，这种培养基仅适合于高渗性霉菌生长，所以严格说来，在此培养基中生长的菌数并不是真正的霉菌总数。但由于饲料中产生毒素的真菌，主要是曲霉属、青霉属
5、和镰刀菌属，其中许多菌种是适应高渗的，因此，选用高盐察氏培养基还是具有一定代表性的。有时为了确切地反映样品中真菌的全貌，还可同时选用低渗性培养基，如马铃薯葡萄糖培养基;为了分离某种类型或特定的产毒真菌，也可用选择性培养基。4 培养温度国标中采用的温度为(25281)。大多数霉菌的最适生长温度为2530，但一些产曲霉毒素的菌株则需要更高的温度，如黄曲霉最适生长温度为35，构巢曲霉为33，烟曲霉为37，因此，培养温度应根据实际情况做适当调整。5 计数范围霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计
6、数是保证结果准确的关键环节之一。在实验中发现，国标中计数范围中采用30100显然不太合适，大部分饲料样品检测中含50100个菌落已较难计数，因此，应尽量选择1050个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对含有菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)，以确保计数的准确性。6 霉菌检测中应注重对污染菌相的分析霉菌种类很多，但能产生霉菌毒素的只限于少数的产毒霉菌，而产毒菌种也只有少量菌株能产生具有危险性数量的霉菌毒素，因此仅对霉菌总数进行检测并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染的饲料的安全程度。关于我国饲料中的菌相
7、分析，这些年来已初步取得结果，我国饲料(粮)中常污染的霉菌有黄曲霉、杂色曲霉、变异曲霉、米根霉、青霞等，其中尤以黄曲霉和杂色曲霉为常见。国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g，蛋白胨10g，柠檬酸铁铵0.5 g，0.2%二氯硝基本胺1.0mL，琼脂15g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，PH值为5.6)可以用于分离黄曲霉毒素产生菌。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30培养23d就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等，取得了满意的结果。因此，针对不同样品，有目的地设
8、计出相应的选择性培养基，以筛选污染菌中的危险菌群，将是一个值得探索的方向。7 总结培养时间：为避免饲料样品中含有生长特别快、菌丝很多的菌，霉菌计数必须在48 h以内开始观察，否则菌丝就会覆盖整个平皿，无法准确计数;如果只作霉菌计数，培养24d已基本达到目的;如果要进一步分类鉴定，则需要培养更长的时间(714 d)。接种方式：霉菌接种采用涂布法比倾注法更合适。计数范围：应尽量选择1050个/平皿的稀释度进行霉菌计数。而对菌丝很丰富、菌落特别扩散的菌株，则应在更少的范围内计数(30个l平皿以内)。培养温度(25281)已经可以满足要求，特殊来源的饲料应根据实际情况做适当调整。仅对霉菌总数进行检测并不能全面反映其危害程度，更重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染饲料的安全程度。
