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1、噬菌蛭弧菌分子生物学特性的研究中国医学细菌中心弧菌噬菌体研究室 秦生巨一、前言噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus,以下简称蛭弧菌)是60年代中期Stolp 等1发现的一类细菌寄生菌。它比通常的细菌要小，有似细菌病毒（噬菌体）的作用，但不是病毒，具有细菌的特性。“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主细菌是蛭弧菌独特的生物学特性。这一生物学特性引起了人们极大的兴趣和关注。20多年来，美国、苏联、日本、法国、以色列、印度等30多个国家和地区的许多实验室对这类菌进行了研究。1982年，秦生巨等在我国首次发现并及时报道了对蛭弧菌的研究。自从蛭弧菌发现以来，国内外许多研究人员对蛭弧菌
2、的生物学、生态学、生理学、分类学、生物化学、分子生物学及其与生物间的拮抗作用进行了研究。特别是70年代后期，对蛭弧菌分子生物学方面的研究更为广泛和细致，发现蛭弧菌在分子生物学方面亦具有许多独特的特性：蛭弧菌不能利用碳水化合物，但分解蛋白质的能力极强，它是利用多肽及氨基酸作为能源和碳源的；蛭弧菌生长代谢过程中乙醛酸循环不明显，以不完全的三羧酸循环为主要代谢途径；蛭弧菌蛋白质含量极为丰富，可达干重的60%65%，DNA含量为5%，含有典型的嘌呤和嘧啶；蛭弧菌DNA合成的前体物质，全部来自宿主菌细胞，大约70%来源于宿主DNA，30%来源于RNA；蛭弧菌可直接利用单核苷酸作前体物质，合成其核酸；蛭弧
3、菌ATP（每消耗1g ATP所得细胞千重）值高达20%30%；蛭弧菌在吸附、侵染、穿入等的整个生命周期中，需要多种酶类的参加；蛭弧菌的鞭毛，粗且带鞘，早期有人认为，鞭毛鞘是由细胞壁外膜组成，对尿素十分敏感。近年来，许多实验室对蛭弧菌的噬菌特性以及利用蛭弧菌清除自然环境河水中的某些肠道致病菌方面，做了许多卓有成效的探索工作。目前已证实，蛭弧菌对沙门菌属、志贺菌属、埃希菌属、假单胞菌属、欧文菌属、变形杆菌属、弧菌属等均有很高的裂解活性，特别是对沙门菌属和志贺菌属。进一步研究发现，蛭弧菌对自然河水中的ElTor霍乱弧菌、不凝集弧菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌、细菌总数、浮游球衣菌、大肠菌群等均有显著的净化
4、作用。本文就蛭弧菌的形态结构、化学组分、能量代谢、生命周期以及蛭弧菌生物拮抗作用等方面的研究阐述如下。二、 蛭弧菌的形态（一）一般形态 蛭弧菌革兰染色，于普通光学显微镜下呈阴性弧、杆菌。相差显微镜下，可见到蛭弧菌积极追捕宿主呈跳跃式的运动。电子显微镜观察、蛭弧菌以弧、杆状为主（图1）。其菌体长约为0.81.2m,宽约为0.250.40m。菌体一端附着一根端生鞭毛，极少数有23根。蛭弧菌的鞭毛比其它细菌鞭毛为粗，直径约为2128nm，长一般为菌体的1040倍，通常呈波状。靠近菌体的最初3个“波段”的“波长”递减，远端“波段”的“波长”相当稳定。这种结构与其侵袭功能直接相关，并被认为是蛭弧菌的又一
5、特征。Shilo等发现，与蛭弧菌鞭毛相对的菌体另一端（头部）有钉状的纤毛结构存在，通常23根，最多可有6根，纤毛直径为4.510nm，长为0.81.5m，呈直线形或三角弯曲状。图（1）蛭弧菌Bd39电镜照片蛭弧菌的形状结构，不同菌株各有差异。而且培养基的选择及培养条件许多因素均可影响蛭弧菌形态特征的发育。（二）超微结构 蛭弧菌细胞壁通常有内外两层组成，内层覆于细胞膜，其上有数个分散的颗粒，直径约为610 nm。蛭弧菌胞浆中常可观察到致密小体，长约150300nm，宽约70120nm，呈片状结构，据推测这可能是细胞膜内陷而形成的。核区非常明显，周围包绕着数个核糖体颗粒。在蛭弧菌的菌体中还可见到间
6、体及其他许多内含物，有人认为间体的存在与蛭弧菌附着宿主有关。当蛭弧菌在深红红螺菌中生长发育时，常见形成异形结构的“孢囊体”，长约为1.2m，宽约为0.6m，孢囊体外壁和内膜都很厚，外壁可厚达3040nm。蛭弧菌的鞭毛结构是独特的，它由鞭毛鞘和轴心组成，鞘壁厚约7.5nm，轴心直径约13nm。Abram等3早期认为，蛭弧菌的鞭毛鞘是由细胞壁外膜延伸而组成的，但是当6 mol/L尿素存在时，鞭毛鞘极易被溶解破坏，而细胞壁不受影响。推测组成鞭毛鞘的物质可能对尿素比较敏感，使鞭毛鞘肿胀，直至破裂。有人认为，蛭弧菌鞭毛的结构与其他革兰阴性细菌的鞭毛结构基本相似，但至今尚未发现蛭弧菌鞭毛基部有类似于其他革
7、兰阴性菌鞭毛基部所具有的L环结构（图3）。图3 蛭弧菌鞭毛基部L环结构模式 蛭弧菌的纤毛基部起源于细胞膜，有612个环状结构，有的分散，有的成簇集结在一起。有人称这一结构为“感染锥子”或“吸附器（固着器）”。这一结构的存在，与蛭弧菌的寄生特性有关，对蛭弧菌进入宿主细胞时机械性钻孔也有积极作用。三、蛭弧菌的化学组成 蛭弧菌具有典形的革兰阴性细胞的化学组分。在这之前，曾有人误认为蛭弧菌细胞中不存在肽聚糖。Tinelli等研究报道，蛭弧菌和其他革兰阴性细胞一样，含有典型的肽聚糖成分，并测得蛭弧菌的肽聚糖成分由胞壁酸、葡萄糖胺及其他13种氨基酸组成，同其他原核细胞壁肽聚糖组分和结构类似，其甘氨酸：谷氨
8、酸二异丙基氟磷酸：胞壁酸：谷氨酰肽比例为2：1：1：1：1。在腐生的蛭弧菌中分离到核糖及rRNA，Bd6-5-S在蛀螺菌中繁殖，则可产生含有氨基糖和可溶性胞壁酸的亚微粒子。Murray报到，锌离子对蛭弧菌细胞壁及细胞膜结构的稳定性很重要，在缺乏锌离子的情况下，细胞壁将会变得十分疏松。蛭弧菌细胞膜的研究发现，其甘油磷脂成分主要是由磷脂酸乙醇胺和磷脂酰甘油组成，他们中主要成分为15碳支链脂肪酸。外膜中的类脂A是利用宿主细胞的类脂A，并经过一定的修饰，插入自身细胞的脂多糖结构而形成。脂多糖主要是由葡萄糖、宕藻聚糖、十九烷酸组成。此外，还含有一些其他脂肪酸、戊糖、酮脱氧锌酸及磷脂。在蛭弧菌外膜中存在类
9、OmpF蛋白。 蛭弧菌的蛋白质含量丰富，可达细胞干重的60%65%，DNA的含量为5%，含有典型的嘌呤和嘧啶，DNA的G+C比例，大多数菌株为50.20.8%50.80.9%，兼性寄生蛭弧菌DNA的G+C比例较低，为42.71.0%42.80.9%。以蛭弧菌Bd109为例，蛭弧菌中主要大分子物质的比例见表1。在蛭弧菌BdA3.12和Bd109中，发现脱氧胞苷酸、尿苷酸、核糖、腺膘呤和鸟嘌呤。到目前为止，除了蛭弧菌DNA的基因位置和装配结构尚不清楚外，还尚未发现蛭弧菌DNA结构成分的特殊性。 表1 蛭弧菌109和大肠杆菌ML35大分子及含量成分蛭弧菌 大肠杆菌g/1010细胞 千重（%） g/1
10、010细胞 千重（%）蛋白质 320 54 2200 54RNA 100 17 830 21 DNA 65 11 110 2.8 脂类 880 14 320 8 多糖 20 3.4 240 6 肽葡聚糖 5 0.8 40 1 干重 590 4000 Thomashow2报道,蛭弧菌鞭毛主要是由蛋白质、磷脂和脂多糖组成,其鞭毛轴心由多肽组成。鞭毛鞘易溶于Triton X-100。蛭弧菌鞭毛鞘不同于细胞外膜，具有特殊的生化性质，有鞭毛磷脂高达54%58%，蛋白质的含量仅为23%28%。与典型的细胞外膜的磷脂、蛋白质的含量有明显差异。这种高磷脂/蛋白质的比率揭示鞭毛鞘中具有磷脂双层结构。同时，与细胞
11、膜的磷脂双层结构相比，具有较大的“流动”性，这可能为鞭毛的运动功能提供了物质结构基础。组成鞭毛轴心的多肽主要由分子量为28kDa和29.5kDa的亚基组成，28kDa亚基位于菌体近端，29.5 kDa亚基位于菌体远端。 蛭弧菌Bd.bdukiz的研究中，发现含有磷脂，其脂质中有的鞘脂类是其它细菌研究中极为罕见的。四、蛭弧菌的菌能量代谢 蛭弧菌严格耗氧，在宿主细胞中生长，所需氧压在533Pa以下，其呼吸率为2010-12m1O2/细胞（35，1h）。当蛭弧菌裂解菌体时，呼吸相应的增高。精氧酸、谷氧酸等氨基酸对呼吸有明显的促进作用。蛭弧菌在综合培养基上能产生细胞色素a（吸收峰605nm）、b(吸收
12、峰559、528、426nm)、c(吸收峰522、524nm)。BdA3.12细胞色素c的索瑞带的吸收峰在607nm,其余在421423之间。蛭弧菌Bd6-5-S含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH2）、烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（DNAPH2）细胞色素氧化酶，DADH2氧化酶的氧化率为DNDPH2氧化酶的2倍。NADH2氧化酶活性受氰化钾和叠氮钠所抑制，但不能被鱼藤酮及4：1一氧化碳和氧气混合物所抑制。NADH2氧化酶不受上述任何抑制剂的抑制。在蛭弧菌Bd6-5-S抽提物中，谷氨酸、-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、丙酮酸、乙酸、-磷酸甘油、烟酰胺腺呤核苷酸及烟酰胺腺嘌呤核苷磷酸不改变耗氧量，
13、但NADH2及NADPH2与耗氧量有关。有人报道，在细胞抽屉提物的微粒中存在三磷酸腺苷酶（ATP酶），同时还存在催化ATP与32P相互转换的酶类物质。由于砷化物、叠氮化合物和2，4-二硝基苯酚对这种转换无抑制作用，因此，这种转换途径可能受氨基酸氧化所催化。氧化NADPH2可能有两种途径：由黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）所刺激，产生过氧化氢，对氰化钾不敏感；通过细胞色素产生过氧化氢，对氰化钾敏感。研究中发现，有些蛭弧菌含有丰富的触酶，但不是所有蛭弧菌都含有触酶。 蛭弧菌Bd6-5-S中含有三羧酸循环所需的异柠檬脱氢酶，-酮戊二酸脱氢酶、延胡索酸水解酶、苹果酸脱氢酶及琥珀酸脱
14、氢酶等。但未发现其糖酵解途径，不能利用碳水化合物及乙醇。蛋白质、多肽、氨基酸及核酸是主要的碳源和能量来源。Mitchel发现，一株海洋蛭弧菌可利用宿主大肠杆菌细胞壁为唯一的碳源。Seidler等5检查了7株蛭弧菌，结果发现这些菌株都含有丙氨酸、谷氨酸、苹果酸，异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸水解酶、腺苷酸激酶、醌还原酶以及四唑氧化酶。但不同的菌株所含的酶类具有不同的理化性质，这一结果用于蛭弧菌分类是实际指导意义的。 Rittenberg等10通过U-14C标记宿主细胞，测得蛭弧菌在细胞内生长时rATP值为18.525.9。一般细菌rATP值为10。达到这样高效果的部分原因，是因为蛭弧菌具有直接从宿主细胞吸收核苷酸的能力。因而贮存了高能磷酸键。在电子转运系统中，每对电子转运产生了3分子ATP（P/O值为3），底物磷酸化作用几乎可以忽略，主要是三羧酸循环及电子转运系统中产能。但其中还是含有低水平的糖酵解酶。在蛭弧菌能量代谢过程中，ATP酶是起主要作用的，约60%80%存在于可溶成分中，对二环已基碳二亚胺（DCCI）敏感，能被其抑制，细胞膜上的ATP酶对DCCI具有抗性，参与蛭弧菌氨基酸及磷酸的转运，对DCCI的抗性主要是由于ATP酶与膜连接后产生的。 Hespll等6对蛭弧菌三羧酸循环及糖酵解途径中各种酶活性进行了分析（表2）。最
