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1、青岛农业大学毕业论文题 目：油茶（Camellia oleifera Abel）三萜皂苷的分离纯化姓 名： 346767 学 院： 园艺学院 专 业： 茶 学 班 级： 2010级1班 学 号： 20103324 指导教师： 张新富 2014年6月15日目 录摘要1Abstract2引言31 材料与方法51.1材料与试剂51.1.1试验材料51.1.2试验试剂51.2 仪器与设备51.3 试验方法51.3.1大孔树脂分离纯化油茶三萜皂苷51.3.2硅胶柱分离油茶三萜皂苷61.3.3硅胶柱二次分离油茶三萜皂苷71.3.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷71.3.5 ODS-C18OPN
2、二次分离纯化油茶三萜皂苷81.3.6 HPLC分离纯化82 结果与分析82.1 油茶三萜皂苷分离纯化流程图82.2 AB-8大孔树脂纯化油茶三萜皂苷102.3 硅胶柱层析纯化油茶三萜皂苷112.4 ODS-C18OPN分离纯化油茶三萜皂苷122.5 HPLC分离油茶三萜皂苷单体组分133 结论与讨论143.1 AB-8大孔树脂、硅胶层析分离纯化油茶三萜皂苷143.2 ODS- C18OPN分离纯化143.3 HPLC分离纯化14参考文献16致谢18油茶（Camellia oleifera Abel）三萜皂苷的分离纯化 茶学专业 冯钰 指导老师 张新富摘要：从天然产物中寻找全新结构的活性物质是现
3、代科学研究的一大趋势，三萜皂苷是其中的热点。油茶三萜皂苷是油茶饼粕中主要的活性成分，但其单体的相关报道较少。本研究以油茶三萜皂苷粗品为材料，利用AB-8大孔树脂吸附油茶三萜皂苷，30%乙醇洗脱出色素等杂质，80%乙醇洗脱出油茶总皂苷，得率为16.6%；硅胶柱进一步分离纯化油茶三萜皂苷，洗脱系统为二氯甲烷：甲醇：水=65:50:8，得率为64.73%；ODS-C18OPN纯化油茶三萜皂苷，50%甲醇洗脱出杂质组分，60%、65%、70%甲醇洗脱出油茶三萜皂苷的不同组分，得率分别为11.76%、23.45%、49.25%，其纯度进一步得到提高；HPLC分离油茶三萜皂苷，0.2%乙酸-乙腈系统进行洗
4、脱，得到两个单峰组分。单体化合物的获得为油茶三萜皂苷构效关系的研究奠定了基础。关键词：油茶；三萜皂苷；分离；大孔树脂；液相色谱分析The Application Separation and Purification Technologies of Camellia oleifera AbelStudent majoring in tea science Feng YuTutor Zhang Xin-fuAbstract: Looking for new active substances from natural products is a major trend in modern sci
5、entific research, and triterpenoid saponins is one of the hot spots. Triterpenoid saponins are the main active components in tea seed pomace (Camellia oleifera), which are very few reports describing successful isolation of saponin monomers. In this study the crude saponins were firstly subjected to
6、 AB-8 macroporous resin column chromatography with stepwise gradients of ethanol and water (at rations of 30:70, 80:20, v/v), its yield is 16.6%; Then triterpenoid saponins were purified by silica gel column with the elution system (dichloromethane: methanol: water =65:50:8), the yield is 64.73%; Tr
7、iterpenoid saponins were further purified by ODS-C18OPN, 50% methanol eluting the impurity components, and 60%, 65% and 70% methanol eluting different saponins, the rates were 11.76%, 23.45% and 49.25% respectively, so the purity of saponins is further improved; Finally triterpenoid saponins were pu
8、rified by HPLC, 0.2% acetic acid acetonitrile system for elution, two single components were isolated. The obtaining of monomer compounds has laid the foundation for the research of triterpenoid saponins structure-activity relationship.Keywords: Camellia oleifera; triterpenoid saponin; separate; mac
9、roporous resin; High Performance Liquid Chromatograph (HPLC) 引言油茶（Camellia oleifera Abel）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）植物，是我国特有的木本食用油料树种。茶皂苷，也可称为茶皂素、茶皂甙，是一类结构较为复杂的齐墩果烷型五环三萜类皂甙混合物，是由皂甙元、糖体和有机酸三部分作为基本结构组成的1,2。油茶籽粕中茶皂苷的含量为10%左右，茶皂苷可以从油茶饼粕中提取而得，是一种具有优良性能的天然非离子型表面活性剂，具有良好的的表面活性以及生物活性，其乳化、发泡、润湿、分散作用显著，并具有溶血、
10、消炎镇痛、抗渗透、抗氧化、抑菌杀虫等生物活性3，因而被广泛应用于水产养殖业、日用化工业、农业生产、建筑业、医药行业、食品加工等各个领域4,5。油茶皂苷传统提取工艺分为两类：水浸法、有机溶剂浸出法3，有机溶剂提取油茶皂素的方法常用于工业中，主要包括过膜法、萃取法、沉淀法、大孔树脂层析法等，但是此类方法分离后纯度较低，其中还会掺杂糖类、蛋白质、色素等杂质，后期还需进行更细致地分离纯化6。目前关于油茶皂苷的分离纯化方法主要有柱层析法、薄层层析法、高效液相色谱分离法等7。水浸法生产油茶皂苷成本低、无污染、投资少、生产简便、见效快，不需用有机溶剂，但是生产油茶皂苷的效率低，产物杂质多，并且损耗大，造成提
11、皂后残渣的营养成分大量流失，降低了提皂后残渣的可饲用性。有机溶剂浸出法生产油茶皂苷效率高、能耗少，产品杂质含量少，但产品成本高、设备复杂、溶剂损耗大，并且用甲醇提取时若设备密封不好会因甲醇挥发而造成对人体的毒害6,7。薄层层析法对于结构相似的成分不能达到较好的分离效果；高效液相色谱分离法虽然灵敏度高、分离速度快，但需要较为完备的仪器设备，并且得到的色谱峰较为集中，分离度较低，保存时间短8。大孔树脂层析法是柱层析法的一种，运用树脂提取分离油茶皂苷的生产工艺是采用水浸提法，利用树脂所具有的选择吸附性能来富集、分离油茶皂苷，用一定浓度的乙醇溶液进行洗脱，回收洗脱剂可获得较纯的油茶皂苷粗品9。研究发现
12、，离子交换树脂对油茶皂苷的吸附容量较高，洗脱率相对较低。张新富等（2012）采用了不同孔径、不同比表面积的大孔树脂进行对比分析实验，结果表明：与其他几种型号的树脂相比，AB-8大孔树脂对油茶皂苷的吸附率和洗脱率较强，均达到85%以上，而且使用不同浓度梯度的乙醇溶液进行解吸时可以有效除去色素、糖类、蛋白质、黄酮类等杂质10。因此选择AB-8大孔树脂层析法纯化油茶皂苷，利用该树脂以水洗脱可以得到色素、茶多糖和蛋白质，30-40 的乙醇洗脱得到茶多酚和黄酮，60左右的乙醇洗脱可得到油茶皂苷，继而可以使茶叶中所含的多糖、色素、蛋白质、茶多酚、油茶皂苷等初步分离开来10-12。HPLC分离纯化技术是目前
13、较为先进的油茶皂苷分离技术，其灵敏度高、分离速度快，多用于油茶皂苷的最终分离13-15。关于茶皂苷单体的报道，研究材料主要集中在茶树（Camellia sinensis）的根、叶、花和种子。关于茶皂苷的探索开始于19世纪末，日本名为青山新次郎的学者在1931年初次从茶树种子中提取出茶皂苷，命名为“Saponin”，而且在其水解实验中得到了糖体以及配基，使茶皂苷实验式的确定成为可能，但是他并没能够从中提取分离出茶皂苷纯结晶1。在随后的几十年里，Masayuki等人对茶树的叶、根、花和种子进行深入研究后分离纯化出56种油茶三萜皂苷单体。1952年，日本石馆守山以及上田阳在茶籽中提取分离出茶皂苷晶体
14、，并确定了茶皂苷的结构组成：皂甙元（C30H50O6）与当归酸以及糖体（包括半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸）相结合16。在20世纪60年代之后，随着科学技术的不断发展以及科研人员的不懈探索和研究，茶皂苷的研究得到了进一步的发展，高分子技术的不断优化让茶皂苷化学结构的确定成为可能，高灵敏仪器陆续诞生，茶皂苷的分离鉴定分析方法和分离纯化技术也在不断提高。目前，高效液相色谱和反相高压液相色谱与质谱相结合已成为分离鉴定茶皂苷的常用方法，尤其是核磁共振技术在茶皂苷单体结构研究领域的应用，为皂苷结构的鉴定提供了便利8。近年来，逐渐报道了一些油茶（Camellia oleifera）和茶梅（Camellia
15、sasanqua）中的茶皂苷，Huang等从油茶（Camellia oleifera）饼粕中分离鉴定出一个皂苷物质sasanquasaponin（C58H92O26，SQS），并研究了它对缺氧损伤内皮细胞的作用17；KUO等从油茶（Camellia oleifera）饼粕中分离了一个茶皂苷混合物，并研究了它对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）的作用18；Sugimoto等从油茶（Camellia oleifera）的花芽中分离鉴定了四个皂苷化合物yuchasaponins A、B、C、D，并以小鼠为模型研究其对胃的保护作用19；MATSUDA等从茶梅（Camellia sasanqua）的花中分离了5个皂苷
