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1、酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药表型与基因型研究肖永红刘健王哲李耘【摘要】目的研究酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药表型与基因型。要领接纳琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性；用双纸片法检测酿脓链球菌耐药表型；用PR要领检测耐大环内酯的酿脓链球菌携带的耐药基因。效果97株酿脓链球菌中82株表示为对大环内酯类抗菌药物不敏感，此中42株表示为LS型耐药，37株为iLS型耐药，3株细菌为自动外排型耐药；82株对大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因，此中12株具有erB基因，25株具有erTR基因，2株具有efA基因，21株
2、同时具有erB/erTR基因，5株同时具有erB/efA基因，3株同时具有erTR/efA基因，9株同时具有erB/erTR/efA基因，5株未能检测到三种耐药基因。结论酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率较高，耐药表型以LS和iLS为主，耐药基因以erB和erTR多见。【关键词】酿脓链球菌大环内酯类耐药表型耐药基因arlidesresistantphentypeandgentypefStreptuspygenesKEYRDSStreptuspygenes;arlides;Resistane;Phentype;Gentype1工具和要领1.1实行细菌选择20012022年来自北京、哈尔滨、南
3、京、天津四都会六家三级甲等病院、经临床分散的上呼吸道熏染和皮肤软构造熏染的酿脓链球菌97株，研究前经北京大学临床药理研究所细菌室重新判断。1.2要领(1)最低抑菌浓度测定接纳LSI/NLS尺度的琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性。抗菌药物尺度品购自中国药品生物成品检定所；造就基及孵育条件：加5%羊血的H琼脂，5%2环境35孵育24h；质控菌为金葡菌AT29213；效果判断参照LSI/NLS2001年尺度。(2)耐药表型的检测接纳双纸片(D实行)法检测对任何一种大环内酯类耐药的酿脓链球菌的耐药表型，红霉素纸片(15g)和克林霉素纸片
4、(2g)均购自中国药品生物成品检定所。将上述两种纸片隔断1520匀称贴于涂布1.5108FU/l菌液的5%羊血H琼脂平板上，352孵箱孵育1824h后不雅察，假设细菌对红霉素与克林霉素均耐药，那么为固有型LS耐药(LS型)；假设对红霉素耐药而靠近红霉素的克林霉素抑菌圈有缺损，呈“D形改变，那么为诱导型LS耐药(iLS型)；假设对红霉素耐药而对克林霉素敏感，靠近红霉素的克林霉素抑菌圈无缺损，那么为自动外排机制所致耐药(型)。(3)耐药基因的检测PR检测对大环内酯类耐药的酿脓链球菌的耐药基因，并通过DNA测序确定。DNA模板的制备接纳SDS裂解法提取酿脓链球菌染色体DNA。PR扩增应用50lPR反
5、响体系扩增er、efA基因，包罗5.0l缓冲液，2.5l/Lgl2，200ldNTP，50pl引物1和50pl引物2，2UTaqDNA聚合酶，50ngDNA模板；PR反响条件：预变性933in，变性941in，退火521in，延伸721in，再延伸725in，共35个循环。efA、erB、erTR基因扩增阳性片断巨细别离为345、557和207bp，以1.5%琼脂糖凝胶，在1TAE电泳缓冲液中100V电泳40in，溴化乙锭染色成像。序列阐发别离拔取两株efA、erB、erTR基因扩增阳性菌株的PR产物送至北京奥科生物技能举行测序阐发，确定扩增产物为目的片断。2效果2.1酿脓链球菌对大环内酯类耐
6、药环境97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素和克拉霉素的耐药率别离为67.0%、45.4%、48.5%、72.2%和60.8%，未创造青霉素耐药菌株。酿脓链球菌对上述几种抗菌药物的I值及耐药率见表1。2.2耐药表型的检测效果97株酿脓链球菌中82株表示为对大环内酯类抗菌药物中的至少一种不敏感，接纳D试验检测其耐药表型，此中42株细菌表示为固有型耐药(LS)，占52.4%，37株为诱导型耐药(iLS)，占43.9%，仅3株细菌为自动外排型耐药()，占3.7%。差异耐药表型酿脓链球菌对抗菌药物敏感性见表2。表1酿脓链球菌对差异抗菌药物的I测定效果表2抗菌药物对差异耐药表型酿脓链球菌
7、抗菌作用2.3耐药基因的检测效果PR效果表白，82株大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因，5株未检测到以上三种耐药基因，此中包罗耐药表型为LS、iLS型各2株、型1株。大多耐药表型与基因型符合，但一株型检测到全部三种基因，而1株iLS型仅检测到efA基因，耐药基因的检测与漫衍环境见图1、表3。2.4地域间耐药表型和基因型的差异本研究的酿脓链球菌来自北京、哈尔滨、南京、天津四个地域20012022年的临床分散菌，创造北京、天津和南京耐大环内酯GAS耐药表型以LS为主，所占比例别离为85.2%(23/27)，75.0%(3/4)，88.9%(8/9)，而哈尔滨那么以iLS为主，所占比例
8、为表3耐大环内酯类酿脓链球菌的基因型与表型检测效果3讨论酿脓链球菌对大环内酯的耐药始于20世纪50年代，比年来随着大环内酯类药物普及应用于临床，酿脓链球菌对其耐药性也明显增长。PRTEKT(19992000年度)监测效果表现3，包罗日本、韩国、我国香港在内的亚洲地域，酿脓链球菌对红霉素的均匀耐药率为18%，此中我国香港地域已到达28%；欧洲国度的均匀耐药率为10%，但地域差异显着；澳大利亚的耐药率仅为4%。我国相干研究资料较为有限，团体来看，大环内酯耐药的酿脓链球菌产生率高于外洋，在40%90%之间15。细菌对大环内酯类耐药机制包罗抗菌靶位改变(甲基化或变异)、自动外排、药物灭活等三种范例，链
9、球菌耐药重要为前面两种6。编码抗菌靶位甲基化的基由于er，表示为对大环内酯类、林可酰胺类、链阳霉素高程度耐药；编码自动外排的基由于efA，表示为对14、15元环大环内酯类低度耐药；差异细菌耐药基因亚型差异，酿脓链球菌为erTR、erB和efA，差异地域视察其耐药基因型与表型漫衍差异较大。PRTEKT(19992000年度)研究表现，来自环球143株耐大环内酯的酿脓链球菌中，以efA基因介导的表型所占比例最高(46.1%)，er基因介导的LS表型位居第二(30.8%)，iLS表型所占比例最低(23.1%)7。西班牙、德国、希腊、芬兰和意大利等国耐大环内酯酿脓链球菌以efA基因介导的表型为主812
10、；法国以erB、erTR基因介导的LS表型为主13；韩国、我国台湾和香港以LS表型为主1416。本研究创造我国临床分散的酿脓链球菌不单对大环内酯耐药率较高，耐药程度也较高，如对红霉素的耐药率为67%，对阿奇霉素更高达72.7%，对克林霉素耐药率在45.4%，且I90均256g/L；耐药表型研表4差异地域耐大环内酯类酿脓链球菌的基因型与表型检测效果(n=82)究进一步证实高度耐药的LS型为我国GAS的重要表型，所占比例达96.3%，远远高于西欧与周边国度程度，至于地域间存在的LS或iLS表型与基因型间的差异，有待进一步研究；分子生物学效果表现，耐大环内酯GAS的基因型和表型同等，绝大多数细菌扩增
11、到erB、erTR基因，efA所占比例极低。这些效果与外洋以efA基因介导的性低程度耐药为主环境不同等，而与我国周边地域和国度环境雷同，这种高程度的耐药是否与我国恒久应用大环内酯类药物有关尚待深化研究。恒久以来，大环内酯类，特殊是新型大环内酯类药物作为临床治疗革兰阳性菌、非典范病原体熏染的治疗药物得以普及应用，但随着细菌对大环内酯耐药的盛行，外洋研究创造，即或是型耐药细菌熏染，大环内酯类治疗失败的时机显着高于敏感菌；结合本研究海内酿脓链球菌对大环内酯类高度耐药环境，临床选用大环内酯类治疗链球菌、葡萄球菌等革兰阳性菌熏染很难得到满足疗效，临床医师在选用药物时必需加以器重。细菌耐大环内酯类er、ef等基因大多携带于可通报耐药遗传物质，如质粒、转座子等，我国酿脓链球菌对大环内酯类何以出现高程度耐药与高耐药率、细菌耐药与临床用药风俗的干系以及耐药基因型与外洋差异等值得进一步研究；别的本次试验中创造5株耐药的酿脓链球菌未检测到三种耐药基因，2株细菌耐药表型与基因检测不同等，是否存在新的耐药基因型大概耐药基因表达差异，亦值得举行深化研究。
