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1、土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选与鉴定及淀粉酶活的测定摘 要：从饭堂门口和生化楼楼下的土壤中分离、纯化、培养获得七个菌株，其中五个为能分泌淀粉的芽孢杆菌，通过一系列生理生化实验，对其中两个菌株的种属进行了初步鉴定，并对其中一株菌所产的淀粉酶活力进行了测定。关键字：土壤 芽孢杆菌 淀粉酶 鉴定 活力 土壤微生物类群在全球自然生态系统中具有不可替代的作用,它推动着生态系统的能量流动和物质循环,维持生态系统的正常运转,是生态系统中的重要组成部分,在土壤中的分布既反映土壤、植物和气候等综合因素对微生物的影响和作用,同时其生命活动也反映出土壤肥力、土壤改良与植物营养的密切关系。芽孢杆菌是土壤细菌中最具活力的
2、部分之一,也是土壤细菌的主要种群之一。本实验通过小组合作，由老师指导，小组自行设计、进行实验，对土壤微生物进行分离、纯化及鉴定，发酵及产物测定，对学生的实验能力进行一个比较全方面的锻炼和培养。（1）了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；（2）掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；（3）掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；（4）培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；（5）对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；（6）从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的
3、分布情况。1.原理及方法概述1.1原理1.1.1芽孢杆菌1.1.1.1形态学特性：芽孢杆菌细胞呈直杆状，0.5-2.5m1.2-10m，常以成对或链状排列，具圆端或方端。细胞染色大多数在幼龄培养时呈现革兰氏阳性，以周生鞭毛运动。芽孢椭圆、卵圆、柱状、圆形，能抗许多不良环境。1.1.1.2生理学特性：芽孢杆菌属，革兰氏阳性，严格需氧或兼性厌氧的有荚膜的杆菌。多数为腐生菌,主要分布于土壤、动植物体表及水体中。该属细菌的重要生理特性是能够产生对对热、pH和盐各种多样性的不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。生孢不被氧所抑制。发现于不同的生境，少数种对脊椎动物和非脊椎动物致病。）1.1.2淀粉酶 淀粉酶是催化
4、淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。目前生产应用的淀粉酶主要来源于微生物，并集中在几种细菌和真菌中，尤其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属中能产生淀粉酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产的淀粉酶有较好的应用价值。土壤中可利用的微生物很多，因此从土壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，能获得有经济价值比较高的菌株。1.1.4生理生化鉴定 由于各种细菌具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物（如糖、醇及各种含氮物质等）不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不相同，因此可利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌。根据伯杰氏细菌学手册，在芽孢杆菌属中，我们鉴
5、定用的生理生化实验有：（1）革兰氏染色试验（2）芽孢染色试验(3)淀粉水解试验（4）吲哚试验（5）VP试验（6）细菌糖发酵试验（葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇）（7）耐盐试验（8）温度实验（9）PH试验(10)柠檬酸盐利用试验(11)硝酸盐还原试验(12)明胶液化试验(13)酪氨酸水解试验(14)酪素水解试验(15)运动性试验（鞭毛穿刺试验）(16)接触酶试验(17)溶菌酶试验(18)卵磷脂试验 (19) 马尿酸盐实验（不做）（20）苯丙氨酸实验（不做）（21）精氨酸水解实验（不做）1.2方法1.2.1分离纯化方法 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。由
6、于芽孢具有较强抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中得到很好的富集。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培
7、养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。1.2.2单染色 用一种染色剂对涂片进行染色，简便易行，适于进行微生物的形态观察。在一般情况下，细菌菌体多带负电荷，易于和带正电荷的碱性染料结合而被染色。因此，常用碱性染料进行单染色，如美蓝、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。若使用酸性染料，多用刚果红、伊红、藻红和酸性品红等。使用酸性染料时，必须降低染液的PH值，使其呈现强酸性（低于细菌菌体等电点），让菌体带正电荷，才易于被酸性染料染色。1.2.3芽孢染色 细菌的芽孢的形状、大小和着生位置是鉴定的重要依据
8、。芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般的染色法只能使菌体着色而芽孢不着色。其方法就是根据芽孢既难以染色而一旦着色后又难以脱色这一特点而设计的。1.2.4革兰氏染色 它可以将所有细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法，可以把它归到生理生化鉴定上。其方法是先用结晶紫初染，再加媒染剂碘液以增加染料与细胞的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成相对分子质量较大的复合物，然后进行脱色（乙醇），最后用沙黄液复染。凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色者为阳性；如被脱色后又染上复染剂颜色（红色）者则为阴性。1.2.5淀粉水解试验 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外
9、淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。因此可用于筛选产淀粉酶的芽孢杆菌。1.2.6摇瓶发酵的测定原理（1）淀粉水解（淀粉酶）生成麦芽糖（还原糖）（2）在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。（3）40时在5min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（U）计算公式:酶活力单位（U）=C酶V酶n
10、（C酶酶液中麦芽糖的浓度 V酶提取液的总体积 n酶液的稀释倍数）2.实验材料与用具2.1材料 土样2种样品1：生化楼楼下河道边样品2：菊苑饭堂后门附近2.2培养基2.2.1牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏 （3g） 蛋白胨（10g） 氯化钠 （5g） 琼脂（15g）蒸馏水 （1000ml）pH 7.2-7.4 2.2.2淀粉水解试验培养基（淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基）可溶性淀粉（2g） 牛肉膏（3g） 蛋白胨（10g） 氯化钠（5g ） 琼脂（15g） 蒸馏水（1000ml）pH 7.2-7.42.2.3硝酸盐培养基 甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100mL乙液（-奈胺0.5g + 5
11、mol/醋酸100mL）硝酸钾(0.2g) 蛋白胨 (5g)蒸馏水(1000ml)pH 7.2-7.4 2.2.4卵黄试验培养基 营养琼脂 (3.3g) 葡萄糖(1g) 配成100ml培养基 卵黄盐水(5ml)卵黄、盐水分别灭菌，按1:1制取培养基与卵黄盐水混合倒平板2.2.5吲哚实验培养基蛋白胨 (10g) 氯化钠 (5g)蒸馏水 (1000ml) pH 7.2-7.4 2.2.6 VP实验培养基 蛋白胨(10g) 氯化钠 (5g) 葡萄糖 (5g) 蒸馏水 (1000ml)pH 7.2-7.4 2.2.7糖发酵实验培养基葡萄糖/木糖/甘露醇/阿拉伯糖 （10g） 蛋白胨(10g) 氯化钠
12、(5g) K2HP04(0.2g) 1溴甲酚紫(3ml) 蒸馏水 (1000ml) pH 7.2-7.42.2.8酪氨酸水解试验培养基 酪氨酸(0.5g稀释到10ml)营养琼脂(3.3g稀释到100ml) （分开灭菌，酪氨酸溶液110，营养琼脂121，用时再混合，）2.2.9酪素分解试验培养基 脱脂奶粉（5g，稀释到50ml） 琼脂（1.5稀释到50ml）（分开灭菌，酪素110，营养琼脂121，现用现倒） 2.2.10运动性试验培养基 可溶性淀粉（2g） 牛肉膏(3g)蛋白胨(10g) 氯化钠(5g)琼脂 (5g)蒸馏水 (1000ml)pH 7.2-7.42.2.11柠檬酸盐试验培养基(制斜
13、面）氯化钠(5g) 硫酸镁(MgSO47H2O)(0.2g) 磷酸二氢铵(1g) 磷酸氢二钾 (1g)0.2%溴麝香草酚蓝溶液 (40mL) 柠檬酸钠(5g)蒸馏水(1000mL) pH 6.82.2.12牛肉汤培养基 牛肉膏(3g) 蛋白胨(10g) 氯化钠(5g)蒸馏水(1000ml) 琼脂(20g)pH 7.2-7.4和pH 5.22.2.13种子培养基可溶性淀粉（2.0%） 酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%） NaCl（0.5%） KH2PO4（0.1%）蒸馏水（100mL）pH=6.02.2.14发酵培养基：可溶性淀粉（2.0%）酵母膏（0.5%）蛋白胨（0.5%） NaCl（0.
14、5%） KH2PO4（0.1%）CaCl22H2O（0.05%）MgSO47H2O(0.05%)FeSO4H2O(0.05%) 蒸馏水100mL pH=6.0（培养基高压蒸汽灭菌：利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温（121 ）灭菌的方法。）2.3试剂 1HCl、蒸馏水、结晶紫染色液、草酸铵结晶紫染液、番红染液、5孔雀绿染色、碘液、95乙醇、乙醚、40NaOH、-酚萘、3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂配制）、1mg/ml麦芽糖溶液2.4仪器钥匙、锥形瓶、水浴锅、胶头滴管、移液枪、试管、培养皿、接种环、玻璃涂棒、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、锥形瓶4个（2个种子培养
15、、2个发酵培养）、试管2.5其他用品无菌防水纸袋、记号笔、标签、报纸、橡皮筋3实验方法与步骤3.1土样采集 样品1：生化楼楼下河道边样品2：菊苑饭堂后门附近近3.1.1以1为单位采用五点取样法在各点采样，距表层5-15，用钥匙在五点处各取1的土壤，装入无菌防水纸袋，封口。称重，编号1、2.3.1.2记录所取2个样品周围的环境状况。3.2筛选菌株3.2.1初步筛选：3.2.1.1称取各土壤样品10g于90ml无菌水的锥形瓶(锥形瓶中放有玻璃珠)1、2中(即为稀释的土壤悬浮液)，塞好棉塞，充分振荡20min，使土壤中菌体或芽孢子均匀分散，并置于80恒温水浴中保持20min，/100恒温水浴中保持10min，以杀死非芽孢的菌体。3.2.1.2取各装有9ml无菌水的试管5支，编号为10-2,10-3,10-4用移液枪吸取1号锥形瓶内土壤悬浮液1ml加入编号为10-2的试管中，并在试管内轻轻反复吹洗数次，即成为10-2的土壤稀释液；同法从编号10-2试管内取1ml加入编号为
