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1、B细胞淋巴瘤SHP 作者：汪清铭， 吴祥元， 王东宁， 林曲， 董敏， 温景芸【摘要】 【目的】探讨JAK/STAT信号转导途径负调控子SHP-1基因启动子区域CpG岛异常甲基化在B细胞淋巴瘤中的意义。【方法】 收集存档石蜡包埋组织标本61例，健康人外周血单个核细胞DNA标本15例，用甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR检测SHP-1启动子区域CpG岛甲基化状态，MSP、un-MSP和RT-PCR方法分别检测接受或未接受去甲基化处理的Burkitt淋巴瘤细胞系Raji的甲基化状态及mRNA的表达， MTT法检测接受去甲基化干预后细胞生长受抑情况。【结果】 SHP-1基因启动子区域在弥漫性大
2、B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤甲基化频率分别为94及97，对照组9例淋巴结良性增生标本和15例正常人外周血单个核细胞标本中SHP-1基因启动子区域甲基化频率为0。经去甲基化干预后，Raji细胞SHP-1基因启动子区域呈去甲基化状态，基因恢复表达，细胞生长受到抑制。【结论】 SHP-1基因启动子区域启动子区域CpG岛在B细胞淋巴瘤中存在高度甲基化，由其所致的SHP-1基因沉默可能是B细胞淋巴瘤发生的一个重要因素，SHP-1基因的甲基化可作为一个良好的分子诊断标记及可能的治疗靶点。【关键词】 淋巴瘤； SHP-1； 甲基化 Abstract: 【Objective】 To investigate th
3、e methylation state of CpG island in the SHP-1 gene promoter which is one of the negative regulators of JAK/STAT signaling pathway and to evaluate its significance in B-cell lymphoma. 【Methods】 Sixty-one paraffin specimens including 52 specimens of B-cell non-Hodgkin lymphoma and 9 specimens of beni
4、gn lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals were studied, methylation state of CpG island in SHP-1 gene in the specimens and Raji cell line were detected by methylation specific PCR(MSP) and unmethylation-specific PCR(un-MSP). The expression level
5、of SHP-1 in Raji cells with or without 5-aza-2-deoxyoytidine treatment were detected by reverse transcriptase PCR(RT-PCR).The inhibitory ratio of Raji cells were measured by MTT assay. 【Results】 The frequency of methylation in SHP-1 gene promoter in large B-cell lymphoma(DLBCL) and follicular lympho
6、ma(FL) were 94% and 97%, control group, however,9 specimens of benign lymphnodes proliferation and 15 specimens of blood mononuclear cells from health individuals showed no methylation in CpG island of SHP-1 gene promotor. The expression of SHP-1 was recovered and the cell growth was inhibited when
7、the cell exposed to the demethylating reagent. 【Conclusion】 SHP-1 gene silencling with aberrant CpG methylation is probably one of the critical events to the onset of B-cell lymphoma as well as important implications for the diagnostic markers and the target of gene therapy. Key words: lymphoma; SHP
8、-1; methylation J SUN Yat-sen Univ(Med Sci), 2007, 28(1): 92-96 SHP-1是一种天然存在于胞浆内的酪氨酸磷酸酶，其通过催化受体相关酪氨酸激酶去磷酸化导致JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)信号转导途径活性下调，是JAK/STAT途径主要负调控子之一，可对抗蛋白酪氨酸激酶的潜在促生长和致癌活性，因此，近年来有学者认为其可能是候选的抑癌基因1。研究表明，基因启动子区域异常甲基化可导致基因沉默，抑癌基因的甲基化及由其所导致的抑癌基因
9、失表达促进肿瘤的发生发展。本研究检测B细胞恶性淋巴瘤中SHP-1基因的甲基化状态，并对Raji细胞系进行去甲基化干预，观察肿瘤细胞SHP-1基因表达情况及其生长状态的改变，探讨SHP-1基因甲基化在B细胞淋巴瘤发生发展中的意义，为B细胞淋巴瘤的诊断和治疗提供新的方向。 1 材料和方法 细胞系与病例 Burkitt淋巴瘤细胞系Raji由中山大学肿瘤防治中心馈赠。52例B细胞非霍奇金淋巴瘤标本为本院1999年2005年间存档石蜡标本，所有标本均经病理组织形态学及免疫组化确诊。滤泡性淋巴瘤35例，弥漫性大B细胞淋巴瘤17例，男33例，女19例，年龄1872岁，平均岁。9例良性非特异性慢性淋巴结炎石蜡
10、包埋组织标本和15例健康人外周血单个核细胞标本作为对照组。 试 剂 UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒、Trizol购自上海生工生物工程公司，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit为日本TaKaRa公司产品，Wizard DNA Clean-up system、MMLV逆转录酶为美国Promega公司产品，MSP阳性对照CpGenome Universal Methylated DNA 购自美国Chemicon公司。 DNA的提取 用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒提取石蜡组织DNA，TaKaRa Genome-DNA Extraction Kit用于细
11、胞系基因组DNA的提取，紫外分光光度仪确定DNA含量及纯度。 甲基化特异性PCR和非甲基化特异性PCR分析亚硫酸氢钠修饰DNA?滋g，三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液调整体积至50 ?滋L，加新鲜配制的3 mol/L NaOH 37 15 min使DNA变性,向已变性的DNA中加入520 ?滋Lmol/L亚硫酸氢钠和30 ?滋L 10 mmol/L氢醌， 55 避光水浴16 h。然后用Wizard DNA Clean-up system 纯化DNA,最后用3 mol/L NaOH,3 mol/L醋酸氨进行亚硫酸氢钠后处理，乙醇沉淀DNA,溶解于50 ?滋L 三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓
12、冲液中，-20避光保存备用。PCR扩增 SHP-1基因甲基化引物:上游:5-GAA CGT TAT TAT AGT ATA GCG TTC-3 (nt:6857-6880);下游:5-TCA CGC ATA CGA ACC CAA ACG-3(nt:7015-6995);扩增产物长度:159 bp。扩增条件：94 预变性12 min， 55 退火， 35个循环。SHP-1基因非甲基化引物:上游：5-GTG AAT GTT ATT ATA GTA TAG TGT TTG G-3(nt:6855-6882);下游：5-TTC ACA CAT ACA AAC CCA AAC AAT-3(nt:701
13、6-6993);扩增产物长度:162 bp。扩增条件：94 预变性12 min， 58 退火， 35个循环。20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶成像系统观察结果。去甲基化干预 用含100 L/L胎牛血清的R?妆?赚?砖1640培养基常规培养Raji细胞，细胞按5104 /mL起始浓度培养于去甲基化试剂5-aza-2，-deoxyoytidine终浓度为1 ?滋mol/L的培养液中，每天更换培养液及去甲基化试剂，以未加去甲基化试剂的细胞为对照，培养第3天后提取DNA,第3、5天后提取RNA,观察基因甲基化状态及表达。 RT-PCR Trizol提取Raji细胞总RNA,用随机引物、MMLV逆转
14、录酶等合成cDNA，按试剂说明书进行操作。SHP-1引物：上游：5-GAC TGT GAC ATT GAC ATC CAG-3;下游：5-CTT CCT CTT GAG GGA ACC CTT-3,产物长度：350 bp；-actin引物：上游：5-CAC TGT GTT GGC GTA CAG GT-3，下游：5-TCA TCA CCA TTG GCA ATG AG-3;产物长度：154 bp，扩增条件：94 预变性4 min，94 45 s，58 45 s，72 1 min，32个循环,72 延伸7 min,以-actin为内参照。20 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外光凝胶成像系统观察结果。
15、细胞生长抑制率的测定 用噻唑蓝还原法检测，取已被5-aza-2-deoxyoytidine作用2 d并处于对数生长期的Raji细胞,调整细胞浓度为5104 /mL,接种细胞于96孔板,每孔加入细胞悬液200 L, 加去甲基化试剂5-aza-2-deoxyoytidine，终浓度分别为0、1、2、4 mol/L，每种药物浓度为1组,每组设6个平行孔,并设空白对照组。细胞培养20、32、44、56 h后加噻唑蓝(5 mg/mL)20 L,继续培养4 h, 离心去上清后每孔加DMSO 150 L,以570 nm为测试波长,630 nm为参考波长,读取吸光度A值,取各复孔吸光度均值，实验重复3次,细胞
16、生长抑制率=(对照组A值- 实验组A值)/对照组A值100%。 统计学分析 用SAS V8软件行卡方检验。 2 结 果 SHP-1基因启动子区域甲基化检测结果 17例弥漫性大B细胞淋巴瘤标本16例存在SHP-1基因启动子区域甲基化，甲基化频率为94；35例滤泡性淋巴瘤标本34例存在该区域甲基化，甲基化频率为97；而对照组标本均为非甲基化状态，?字 2分别为及，P 。电泳图MSP呈阳性条带，unMSP呈阴性条带提示该标本基因启动子区域呈甲基化状态；如unMSP呈阳性条带MSP呈阴性条带，则说明该标本基因启动子区域呈非甲基化状态。电泳结果均经测序证实，MSP阳性条带测序示CpG岛CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修饰后仍旧为C,证实该位点为甲基化状态；unMSP阳性条带测序示CpG岛CpG二核苷酸中的碱基C被亚硫酸氢钠修
