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1、考力代绵羊选育与种质资源开发利用项目技术报告一、研究的目的意义考力代绵羊是贵州半细毛羊培育的主要父本，已适应在山区高寒、高湿条件下生长，成为毕节市本土化绵羊品种，深受老百姓喜爱。由于农户饲养方式较传统，品种选育意识不高，以致该品种出现退化现象，生产性能在下降，存在养殖比较效益不高的问题，所以，开展考力代绵羊的提纯复壮，对推进毕节市养羊业的发展具有重要意义。二、主要研究内容1、开展提纯复壮研究。采取传统选育及分子标记辅助选育相结合的方法，使考力代羊生产速度、繁殖性能有所提高。2、开展营养调控研究。组建试验羊群，设计营养配方，进行饲料配方筛选。3、开展杂交试验研究。导入生长速度快、繁殖性能高的外血
2、品种杂交，观察后代生产性能，为新品系培育奠定基础，为考力代羊开发探索新路子。三、项目研究内容完成情况（一）考力代绵羊提纯复壮研究1、核心群的组建项目经过初步选择标准选择后，建立了核心群。核心群成员除了以上的种羊外，以后不断地从其后代羊群中挑选成绩优秀的个体，对核心群进行补充和扩大，不断提高核心群的总体水平，核心群组建后，由于有后代的参与，要做好每只羊的档案记录和配种安排，避免近交衰退。通过选种选配和后裔选择，在贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司种羊场建立了核心群（表1）。表1 考力代绵羊种羊选择标准 单位：kg、cm类别体重毛量毛长备注成年公羊554.511.0群体要求羊毛主体细度50-58支，净
3、毛率50%，产羔率100%。成年母羊353.09.0一岁公羊403.511.0一岁母羊282.59.0 2、生产性能 （1）体重水平项目实施后，核心群周岁公、母羊体重55.76kg、45.69kg，比选育前提高15.66%、15.76%；核心群成年公、母羊体重65.86kg、49.72kg，比选育前提高24.24%、17.26%。（表2）。表2 实施前后核心群体重统计 单位：kg、只类别性别周岁成年种羊实施前实施后实施前实施后核心群公羊48.210.6855.764.3553.011.2265.865.15母羊39.471.2545.693.8442.41.0549.724.72（2）产毛量、
4、羊毛长度及细度根据测定，成年公、母羊产毛量分别为5.88kg、4.86kg，提高5.76%、17.96%，羊毛长度分别为12.785.23cm、11.234.95cm，羊毛细度分别为28.445.1um、27.865.72um（表3）。表3 产毛量、羊毛长度及细度测定统计 单位：kg、cm、um类别成年公羊成年母羊（kg）实施前实施后实施前实施后产毛量（kg）5.565.880.884.124.861.52羊毛长度（cm）9-1312.785.239-1311.234.95cm羊毛细度（um）28.445.127.865.72（3）屠宰率测定屠宰周岁羯羊3只，周岁羊屠宰率为51.01%，净肉率
5、34.54%（表4）。表4 考力代绵羊屠宰测定年龄编号宰前活重（kg）胴体重（kg）净肉重（kg）屠宰率净肉率（%）（%）周岁羯羊155.528.219.250.81 34.59 256.428.919.851.24 35.11 355.728.418.950.99 33.93 平均55.87 28.50 19.30 51.01 34.54 （4）产羔率项目点产羔统计，平均产羔率为112.32，繁殖成活率达91.6%。可见考力代绵羊产羔率低，还需加强双羔母羊的选择（表5）。表5 考力代绵羊繁殖性能统计年度母羊胎次（胎）产羔数（只）成活羔数（只）成活率（%）产羔率（%）2016.12017.13
6、2636433291.2111.662017.12017.1258365760491.9112.69平均45551146891.6112.32（二）生长速度、繁殖性能和毛用性状相关基因分子标记研究对影响毛羊的生长性状的基因GHSR、CIS、繁殖力性状的基因GDF9、BMP15、ESR、毛用性性状的KRT26为侯选基因进行筛选，采用PCR产物直接测序法对上述基因进行单核苷酸多态性检测，以期寻找到与高繁殖力，高生长，毛用性能好相关的SNPS，确定基因效应，探求与三个性状相关的遗传标记，为考力代绵羊的进一步选育提供理论依据。（1）实验样品：考力代绵羊选自马干山种羊场，自繁自养，健康状况良好的基础经产
7、母羊共36只。（2）实验方法采集样品：每只羊通过颈静脉采集血液，装在真空抗凝采血管中，快速振荡混匀，放入冰盒，带回实验室-20冰箱保存备用。羊基因组DNA的提取：采用EZUP柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，并用紫外分光光度计测量其浓度测OD值，计算 OD 260 / OD 280 比值，若比值接近 1.8 ，说明样品中的蛋白质去除的比较干净；若比值小于 1.6 ，说明样品含有较多的蛋白质或其它离子， DNA抽提效果不好，需重新提取。引物：根据 GenBank 发表的绵羊GDF9基因(登录号：NC_019462)的第二外显子、BMP15基因(登录号: NC_019484.1)的第二外显
8、子、ESR基因(登录号:NC_019465.1)部分外显子序列，GHSR(登录号: NM_001009760.1)，CISH (登录号:NC_019476.1)、KRT26(登录号: XM_004012872.1)第一、二外显子，采用Primer5.0软件自行设计引物，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表6 。表6 引物序列、产物长度及退火温度引物产物长度上游引物序列( 53)下游引物序列( 53) GDF9768bpGCTCCATACTCATTTACCTATGAAGATATGATAGCCACTBMP15774bpCTTCACCTAACTCATTCCCACTACTCCCATACTA
9、ACGGGTCAG ESR712bpATTCGCTCGCTCGGTTCTATAGGGGGAGGTGAGGCTTGGTTGHSR549bpTCACTCATTATTCTACACCAGAAGCACACCCAATFTCCAAATTAAGG CISH765bpCCAGGGAGAGGTGAGGAGAATTTACTGGGTGCCCTAGCAGKRT26841bpGGGCCAGCTTTCCACCTACCCAAGCGCTGGGAATGTAGT 使用真空冷冻干燥的OligoDNA为白色粉末，附在离心管内壁上。稀释前，将引物管离心数秒使 DNA 聚集到管底，加入100倍摩尔数的双蒸水，盖好管盖，涡旋震荡混匀并使其充
10、分溶解，然后再离心数秒，保存4冰箱过夜。第二天取出放入-20保存备用。PCR产物检测：取PCR扩增产物4l,同时用DL2000DNAMarker作参照，点样于1%琼脂糖凝胶中电泳，电压120V，电泳25min。电泳结束后将琼脂糖凝胶放在凝胶成象系统上观察并记录扩增片段的大小和浓度，选取扩增效果好且量足的样品进行后续实验。测序和BLAST分析：将特异性好、产量高的PCR产物委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行纯化和双向测序，测序结果利用 DNASTAR 软件对测序结果进行校正，BLAST分析确定SNPs。（3）结 论根据绵羊GDF9基因序列的第二外显子、BMP15基因序列的第二外显子、ESR基
11、因部分外显子、GHSR基因的第二外显子、CISH基因的部分外显子、KRT26基因的第二外显子序列设计引物，采用PCR产物直接测序法检验在品种中的基因多态性，并与产仔数，生长性能，毛用性能进行相关分析，结论如下：一是对六个基因进行PCR扩增，确立了最佳PCR反应条件和反应体系，对PCR产物纯化后进行直接测序，测序结果显示考力代绵羊品种的三个性转的六个基因中，影响繁殖性状及生长性状的五个基因均为中度多态，而影响毛用性能的KRT26基因比较稳定。二是检测GDF9基因在第2外显子的562 bp处有 1个AC的单碱基突变,碱基突变导致谷氨酰胺突变为脯氨酸。考力代绵羊产羔数在两个基因型之间呈现出ACAA，
12、差异极显著( PCC，差异显著(PGG，差异显著( PTGGG，差异极显著(P0.01 ) 。五是在GHSR基因中检测出2个单碱基突变。T70G和G229T均引起氨基酸同义突变。突变前后GHSR基因RNA二级结构发生改变，最小自由能由-378.3 KCal/mol变为-377.6 KCal/mol，并影响到蛋白质二级结构的稳定性。六是在CISH基因中检测出第二外显子的213bp处有一个TC的单碱基突变，为同义突变，没有引起氨基酸的改变。七是影响毛用性能的基因KRT26没有突变发生，结构比较稳定，不会引起考力代绵羊毛用性能发生改变。（三）考力代绵羊导入外血提高生产性能的杂交组合试验项目实施中开展
13、两个杂交试验，分别利用陶赛特绵羊和萨福克绵羊与考力代绵羊杂交，陶考杂F1代、萨考杂F1代3.5月龄断奶体重分别为16.342.94kg、18.754.53kg，比考力代15.194.28kg分别提高了7.57%、23.44%，杂交试验效果显著（表7）。表7 杂交试验统计父本品种母本品种初生重（kg）3.5月断奶重（kg）杂交F1比纯繁提高比例考力代考力代3.654.4315.194.28陶赛特考力代4.124.6716.342.947.57%萨福克考力代4.755.4218.754.5323.44%（四）设计配方，筛选饲料配方 根据贵州新乌蒙生态牧业发展有限公司饲料原料情况筛选出的相关饲料配方见表8-16。表8 考力代绵羊种公羊非配种期全混日粮配方及营养成分原料配比/%营养素含量/%玉米42.0干物质85.38麦麸10.0消化能/（兆焦/千克）11.50玉米秸秆35.0代谢能/（兆焦/千克）9.43豆饼10.0粗蛋白11.07磷酸氢钙1.0粗脂肪2.73石粉1.0中性洗涤纤维35.74食盐0.5酸性洗涤纤维24.83预混料0.5钙0.62合计100磷0.44表9 考力代绵羊空怀和妊娠前期母羊混合精
