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1、巨噬细胞集落刺激因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的促进作用【摘要】 本研究以内皮细胞培养液培养小鼠骨髓内皮细胞，探讨粒巨噬系集落刺激因子对骨髓内皮细胞增殖的影响。用EndoM培养小鼠骨髓内皮细胞，通过WrightGiemsa染色计数内皮细胞集落、应用免疫荧光法观察内皮细胞表型；加入不同浓度的GMCSF，通过集落形成率、MTT法和流式细胞术检测内皮细胞生长周期，观察GMCSF对内皮细胞体外扩增的影响。结果表明： EndoM诱导的骨髓细胞可以生成内皮细胞集落，vWF检测呈阳性；集落形成率检测及MTT法测定均证实GMCSF对内皮细胞的增殖具有明显的促进作用；生长周期检测结果显示， GMCSF处理组的细胞进
2、入S期的比率为%，而对照组为%，说明GMCSF可以通过促使内皮细胞进入S期而加快细胞的分裂，促进细胞增殖；比较第1代和第4次传代后细胞的生长曲线，两者无明显差别，说明多次传代后的细胞仍保持传代早期的增殖潜能。结论： GMCSF对内皮细胞的增殖具有促进作用，经多次扩增传代后内皮细胞的增殖潜能无明显改变。【关键词】 骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖Effects of GranulocyteMacrophage Colony Stimulating Factor on Growth of Murine Bone Marrow Endothelial Cells Abstract The purpos
3、e of this study was to investigate the effects of granulocytemacrophage colony stimulating factor(GMCSF) on the growth of mouse bone marrow endothelial cells. Endothelial cell culture mediumwas used to culture murine bone marrow endothelial cells. Endothelial cell colonies were counted under microsc
4、ope by WrightGiemsa staining. The effect of different concentriation of GMCSF on the proliferation of bone marrow endothelial cells was observed by the formation of endothelial cell colonies, MTT and flow cytometry. The results indicated that the endothelial specific marker vWF was expressed by the
5、colony cells ,GMCSF promoted the proliferation of bone marrow endothelial cell colonies and MTT confirmed the effect of GMCSF on promoting the proliferation of bone marrow endothelial cells. The result of detecting cell cycle showed that the rate of cells entering into S phase was % in GMCSF added g
6、roup and the rate of cells entering into S phase was % in control. There was no significant difference in cell growth curve between the first passage and fourth passage. It is concluded that GMCSF can promote the proliferation of bone marrow endothelial cells, the proliferation potential of bone mar
7、row endothelial cells between the first and fourth passage no significantly changes. Key words bone marrow endothelial cells; GMCSF; proliferation J Exp Hematol 2007; 15(3):622-625 目前，已有许多报道证明内皮细胞、内皮祖细胞可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血1,2也可以用于组织工程的血管构建3，并取得了一定的成果。Kawamoto等4报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织
8、的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等5则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显着增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。 内皮细胞的来源有多种， 可以从外周血、脐血及骨髓中获得6，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮
9、细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。 动物 昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。 主要试剂和仪器 IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2 培养箱购自美国Forma。 小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养 用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1106个小鼠骨髓单个核
10、细胞种入1 ml含有15%新生牛血清的EndoM 培养体系，置于24孔板中，于37、5% CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以50个细胞的聚合计为1个集落。 内皮细胞的形态观察及vWF的检测 培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小
11、时，加入v WF抗体，4过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株7为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。 不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响 取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5 000个细胞，在基本培养体系的基础上分别加入5、10、25 ng/ml的 rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。 GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定 将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5 000个/孔
12、培养于96孔板，每孔 ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100 ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37、5% CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM 180 l和20 l MTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO 150 l，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值。 生长曲线 纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5 000个细胞，加 ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25 ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、
13、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式 DT=t1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。 细胞周期的流式细胞术检测 无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2106个细胞种于6孔培养板中，置于37、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞， 200g, 离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300 l PBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇约7
14、00 l，将细胞放于-20过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。 细胞传代培养 取小鼠骨髓单个核细胞，按2106个细胞种于6孔培养板中，置于37、5% CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100 ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按14传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100 ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按14传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式 DT=t1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。 统计学处理 实验数据
15、为3次结果，以meanSD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，表示有统计学意义。 结 果 细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5 000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF 5、10、25 ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多，说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。 rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响 小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显着 。 GMCSF对EC细胞周期的影响 运用流式细胞仪检测细胞周期，观察G
16、MCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为%，与对照组%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖。Figure 5. Effect of GMCSF on cell cycle of endothelial cells. A: group treated by GMCSF. B: control group. 体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响 图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式DT=t1g2/(1gN-1gN0)计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为小时、小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明
