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1、大提质粒1. 单菌落接种到5 ml含抗生素的LB培养液中（试管体积应比培养液至少大4倍；试管 不应盖得太紧；转速应很剧烈）。2. 当OD600=0.6时倒入含抗生素的250 ml LB培养液，37C 300 r/min培养约14-18 h。3. 4,000 rpm, 10 min, 4 C收集细胞。4. 去上清，加solution I 8 ml,涡旋振荡重悬（4 C ）至溶液均匀无块状菌团。5. 每管加入solution II 16 ml轻柔上下颠倒20下彻底混匀，置冰上5 min （时间不可过长）。6. 每管加入solution III 8 ml （4 C）,立即轻柔地上下颠倒，彻底混匀，使
2、沉淀均匀混于溶液 中，呈现絮状而非团状，冰上放置10min。7. 平衡后，4C，12,000 rpm, 20 min。8. 将上清经两层神奇滤布（DDW润洗）过滤至新50 ml离心管中（约30 ml）加入 0.6V （约18ml）异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温，30 min。9. 平衡后，室温，12,000 rpm, 20 min。10. 小心弃上清，离心管敞开盖，倒置以去残余上清。室温下70%乙醇涮洗管底及管壁，倒掉乙醇，倒置去净乙醇，待挥发无味后（不要太干燥）加入总量4.2 ml DDW or 6.2 ml】。11. 转入15ml瘦型离心管中，加入CsCl 6 g or 8 g】（终浓度1
3、g/ml），EB 120l or 160l】 （母液浓度10 mg/ml）。12. 缓慢加入超速离心管6 ml【or 8 ml】，管内要装满，不能有气泡，精确配平（精确值0.01g）。13. 超速离心60,000rpm （250,000 g）， 16 h， 20C。升速调至次最快，降速调至no brake。14. 收集闭环条带：用10ml注射器针头在离心管顶端扎一个小孔；将10ml的一次性注射 针器针头斜面向上插入闭合环下方约1cm处，针头的斜面开口正好位于较低的DNA区带（闭 环质粒DNA）下方；缓慢吸出质粒DNA，小心不要搅动上方粘稠的染色体DNA区带。15. 取等体积SSc饱和异戊醇上层
4、加入离心管，反复上下颠倒混匀，静置5-10min，吸除上 层含有EB的有机相，重复10次左右，直至溶液不含红色EB。最后一次抽提可静置60-90 min【通风橱中操作】。16. 吸300皿质粒溶液入进口 Ep管，加入1.2 ml （4V） 70%乙醇颠倒混匀，沉淀质粒，室温，30 min。17. 小离心机，13,000 rpm,15 min，室温。18. 加入600l， 70%乙醇洗一次，13,000 rpm， 3 min，室温。倒掉酒精，甩一下，用枪吸 除剩余液体，放置5 min，呈半透明状，加DDW 200皿（依量而定）溶解。19. 稀释10倍或100倍，取2皿NANODrop测定浓度，再
5、取500ng跑电泳。List：1. Solution 1： 50 mM 葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl （pH 8.0） / 10 mM EDTA （pH 8.0）； 4C存放51 100ml葡萄糖（Glc）0.9908g1M Tris Cl2.5ml0.5M EDTA 2.0ml2. Solution 2： 0.2 N NaOH / 1% （m/V） SDS；（配 10 N NaOH, S2 要现配，先加水）52 100ml10N NaOH2 ml10% SDS10 ml3. Solution 3 （4C存放）53 100ml5M乙酸钾 60.0ml （MW=98.14g/mol,
6、or直接称取29.442g乙酸钾固体）；冰乙酸11.5mlH2O28.5ml；4. 异丙醇 isopropanol；5. CsCl （固体）；6. EtBr （10 mg/ml）；7. 石蜡油8. SSc饱和异戊醇20xSSc： 800 ml DDW溶解175.3 g NaCl和88.2 g柠檬酸钠，用几滴14mol/L浓盐酸调pH 值=7，用水定容至1 L,分装（分在两瓶）后高压灭菌。SSc饱和异戊醇：200 ml 20xSSc与300 ml异戊醇充分颠倒混匀，室温静置分层（放置过夜， 提前准备）。使用时吸取上层。9. 70%乙醇10. LB培养基（每瓶250ml）11. 神奇滤布，离心瓶（
7、两种：离心菌的，沉淀DNA的）12. 冰13. 10 ml注射器若干14. 提前预约超速离心机拟南芥原生质体转化（所有药品均为进口）1 .打开水浴锅，TM=55C2,配10 ml酶解液（8种试剂），置于培养皿中【10ml酶解液，40片叶子，约产出3x106 protoplasts 】酶解液（8种试剂）【现配】40 ml10ml15mlCellulose R100.6 g （不要粘在管壁上）0.15g0.225gMacrozyme R100.16 g0.04g0.06g0.8 M Mannitol20 ml5ml7.5ml2 M KCl0.4 ml100pl150pl1M MES0.8ml200
8、pl300pl55 oC, 10 min（严格，前边摇2-3次，待管壁不再粘有酶，溶液澄清就不用摇），待酶液 自然降至室温，加入 0.4 mL【10ml-100|il； 15ml-150|il】1M CaCl2母液以及18.4 mL 【10ml-4.6ml； 15ml-6.9ml】DDW （补足 40ml），0.04 g BSA【10ml-0.01g； 15ml-0.015g】， 最终酶液应为清亮棕色溶液，0.45pm滤膜过滤。3. 将0.4 M mannitol滴至一次性培养皿上，将叶片切成细丝，一刀一刀断开切，忌来回蹭。4. 23 oC避光酶解2 h （或3 h，放置时间较长的酶液），40
9、 rpm。收获前75 rpm，摇1 min。5. 配PEG【至少转化前1h配制，以便PEG完全溶解，室温放置】，提前将BD 50 ml离心 管置冰上。PEG【最好现配，不灭菌】5mlPEG 40002 g0.8 M Mannitol1.25 ml1 M CaCl20.5 mlDDW1.5ml6. 用等体积W5稀释酶/原生质体溶液，尼龙膜（W5润洗）过滤至50 ml离心管收集原生 质体，100 g， 3min， 23 C，升速3，降速3离心7. 用5 ml大枪头吸除酶液，原生质体多则把酶液吸净，少则留一点酶液，加入10-20 ml W5 （依量而定）洗涤。100 g， 3min， 23 C，升速
10、3，降速3离心8. 吸去上清，再加入20 ml W5,轻摇离心管重悬原生质体。冰上30min，镜检，Hemacytometer 血球计数板计数。100 g， 3min， 23C，升速3，降速3离心。9. 吸净W5上清，加入2-3 ml Mmg重悬，使原生质体浓度达到1.5-2x106 ml-1，冰上放置。10. 加15pg质粒DNA至2ml离心管中，沿管壁缓慢加入150pl原生质体溶液【每次取的 时候重悬混匀原生质体】，轻轻充分吹打混匀。立即缓慢加入150pl PEG溶液，呈两层，轻 柔颠倒充分混匀，不要有PEG溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。11. 加完PEG后每管室温放置8-15min
11、。（PEG刚加入时要分层，否则转化效率不高）。大反应：取50 ml离心管，每管加入120 pg质粒/每一种，然后用枪吸打混匀，阴性对照加 一种质粒，然后用水补齐使总体积一致，然后用枪吸打混匀。冰上放置。50 ml离心管中加 入3 ml原生质体溶液，沿管壁缓慢加入，充分摇匀。每次室温摇匀后随即每50 ml离心管加入3 ml PEG溶液，轻柔颠倒混匀，不要有PEG溶液一点一点，而应是充分均匀的溶液。 加完PEG后每管室温放置8-15 min。12. 好的情况下，此时不应看见有沉渣。加入赤1室温W5【W5沿管壁轻缓流入管底】，马 上轻轻颠倒混匀，终止反应。盖子一定不要盖得太紧，100 g，3min，
12、23C，升速3，降速3 离心。14. 吸除上清，留约1001，再加入1ml W5，100 g，3min，23C，升速3，降速3离心。15. 吸除上清，再加入1-2m1 W5,重悬原生质体，置于12孔板中，室温，放置于白色白炽 灯下，液体不要粘在盖子上，用一张白纸遮盖住（光不要太强），放约12-18 h。注意事项： 3-4周的未经移苗的植物：取刚刚完全展开，叶面光滑，非凹凸不平的，最上面最 中间的叶片，依次向下选取，取瘦长的，叶缘尖锐的叶片为佳，以第5-7片真叶为佳。每四 棵苗取8-10片叶子。 每次做大反应（用于CO-IP）最多做8管，每管需3 ml原生质体溶液，浓度为106， 10 ml酶液
13、需40片叶子。小反应用于做蛋白定位，每管需200 pl原生质体溶液，20瞄质粒。 提出原生质体后每一步都要动作轻缓，以免原生质体破裂，操作间隙置冰上。100ml W5【室温保存】1 M MES1 M CaCl22 M KClNaClDDW200 pl12.5 ml 250 pl 0.9009gadd to 100ml20ml MMG【室温保存】1 M MES80 pl0.8 M Mannitol10 ml1 M MgCl2300 plDDWadd to 20mlList：1. 水浴锅，摇床，冰，0.4 M mannitol2. 0.45pm （or 0.22pm）滤膜，培养皿，量筒，刀，75 pm尼龙膜，锡箔纸，计时器，弯头 镊子（用于撕叶片下表皮）3. 显微镜，移液器，移液管（最好灭菌），血球计数板，50 ml/2 ml离心管（进口）4. 6/12 孔板（6/12-well tissue culture plate）5. PEG现配，提前把质粒稀释到所需浓度（2pg/pl），准备好Confocal：1. 准备：确认预约时间，剪枪头2. 样品及锡箔纸，枪头（剪过的，未剪的），枪，载玻片，盖玻片，笔，签字笔，记录本，Ep管及板，DVD盘，剪刀，羊毛脂，擦镜纸3. 每一次照完照片立即命名
