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1、细胞传代培养（消化法）具体操作： (?k 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴锅内预热。 v V-f&5W 2.用75酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。I 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 O_ K 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 F5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 O/u O%6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。06Es7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微
2、镜的台面，再在镜下观察细胞。F + )V 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 7t二.胰蛋白酶消化； -mm-,x 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。+2 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 &三.吹打分散细胞： u 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 o2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中
3、。 X|OH4S/6y 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 S3 %J4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 u0%) 四.分装稀释细胞： (T0 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2Q 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5105/ml。最后要做好标记。五.继续培养： t2o;e6f 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁
4、上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25时为一个，占50为，占75时为。 g3aZ 传代细胞培养注意事项： ;P? W 1.严格的无菌操作 .aSu*0G8 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 m+)C5d 附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： S8s/7 EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20m
5、in高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。 OSoW- p 细胞的复苏 T7;3kJ 细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 fZ/G:X8q 具体操作 b#Ok1yU) 一. 实验前准备： aORUI3-y 1.将水浴锅预热至37 AJ +lD. 2.用75酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 (NX%|O=l9 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 #=DwVV
6、u 二取出冻存管： !xo:2(- 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 OUUV) 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 &8;BW: 三迅速解冻： &9rk)!x( 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 1$ 0A/! 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 A!G 四.平衡离心： %)P=Be 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min ZK 五.制备细胞悬液： _YUXDh 1.吸弃上清液。 $ Vt3U/A 2.向离心管内加入
7、10ml培养液，吹打制成细胞悬液。n 六.细胞计数： &/OF9Ue 细胞浓度以5105/ml为宜。 +_七.培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37和5CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 a v=/c 初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37。 JkNI_ J 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 =br3M,d 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 1D/T9&Yd* 4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞传代培养 一、原理 细胞在培养瓶长
8、成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1、细胞：贴壁细胞株 2、试剂：0.25胰酶、1640培养基（含10小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等 三、操作步骤 1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2、加入0.51ml 0.25胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆
9、形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为13分钟。 4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 附：消化液配制方法： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hanks液溶解，滤器过滤除菌，4保存，用前可在37下回温。 胰酶溶液中也可加入EDTA，使最终浓度达0.02。实验：细胞的原代和传代培养1.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医
10、学上的应用打下基础。 2.实验原理 从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首
11、次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。 3.实验用品 3.1材料和标本乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞) 3.2器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。 2.3试剂含有5小牛血清的
12、MEM培养液、0.01molLPBS，0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液、75乙醇。 4.实验方法 4.1原代细胞培养 4.1.1原理 细胞培养(Cellculture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
13、 4.1.2操作 取材 用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。 切割 用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 消化、接种培养 吸取0.25胰蛋白酶一0.02EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37水浴中消化810分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组
14、织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入510ml含5小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。 4.1.3结果 细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。4.2传代细胞培养 4.2.1原理 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增36次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。 常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.20.5，肿瘤细胞可达35。细胞接种23天分裂增殖旺盛，是活力最好时期
