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1、以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(pH7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶, 则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。现把几种常用pH 缓冲液配方提供如下: 1.5.1 pH7.5磷酸盐缓冲液 (0.02mol/L) 称取磷酸氢二钠(Na2HPO412H2O)6.02g和磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.5g以蒸 馏水溶解定容至1000mL。 1.5.2 pH 2.5乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。 取A 液16
2、mL与B 液1mL混合稀释一倍即成。 1.5.3 pH 3.0乳酸-乳酸钠缓冲液 (0.05mol) A 液: 称取80%90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。 B 液: 称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。 取A 液8mL与B 液1mL,混合稀释一倍即成。 1.5.4 pH 10硼砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.05mol)。 B 液: 称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL (0.2N)。 取A 液250mL,B 液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。 1.5.5 pH 11.0硼
3、砂-氢氧化钠缓冲液 A 液: 称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL 。 B 液: 称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL 。 取A 液与B 液等量混合。 1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。请问50mmol/L的乳酸钠缓冲液（PH4.5）和125mmol/L的酒石酸钠缓冲液(PH3.0)如何配制？从瓶子上查1mol/L的试剂要加多少水，按比例加，然后分别稀释20倍，8倍就行了。 调PH比较麻烦， 配50mmol/L的乳酸钠 用乳酸调到PH4.5 125mmol/L的酒石酸钠缓冲液(PH3.0) 用酒石酸/氢氧化钠调到3.0 调PH的原
4、则是不引入其他离子。有这个公式的 无机化学上有 缓冲溶液buffer solution 缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们时蛋白质、重碳酸盐缓冲体系。每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。 在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活
5、。所以我们要学会配制缓冲溶液。 由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tiris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。 硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。 柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。 磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓
6、冲能力很小。 三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4时是8.4，在37时是7.4，因此，4配制的缓冲液拿到37测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力很差。 缓冲液的pH值由哪些因素决定？ 设缓冲系统的弱酸的电离常数为K（平衡常数），平衡时弱酸的浓度为酸，弱酸盐的浓度为盐，则由弱酸的电离平衡式可得下式： 根据此式可得出下列几点结论： （1）缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数K及盐和酸的浓度有关。弱酸一定，但酸和盐的比例不同时，可以得到不同的pH值。当酸和
7、盐浓度相等时，溶液的pH值与PK值相同。 （2）酸和盐浓度等比例也增减时，溶液的pH值不便。 （3）酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，一般地说缓冲液有效缓冲范围为PK1pH。 从上述可知，只要知道缓冲对的PK值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度）时，可按公式计算出盐和酸的量。这样算涉及到对数的换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，经计算已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系列出了表格。讲义附录部分节录有磷酸缓冲液的配制表。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算处所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nmpH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。 经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升，而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。 计算好后，按计算结果称好药品，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，便得所需的缓冲液。 各种缓冲溶液的配制，均按下表按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确的浓度才能进行，如醋酸、NaOH等。
