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1、血管内皮细胞体外培养1概述 血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.11m，长约2550m，宽约1015m，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免
2、疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。2培养方法 EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。2.1 方法原理 用酶消化法，酶消化机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分
3、离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。2.2 介绍几种主要EC的分离2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管）a 在37水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。b在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 g/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。c注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射
4、器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37无菌的D-Hanks液中，消化15min后取出。d收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心710min。e去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。f其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉 因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分
5、离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化1520min后，见酶液稍有混浊，即加入等量的含20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。 c收集消化后的酶溶液以1500r/min离心5min，弃上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞。 2.2.3 酶消化机械刮脱法猪主动脉EC的分离 a麻醉状态下，在颈部切口，分离并剪断颈动脉，
6、放血处死。在无菌条件下，作胸腹联合切口，迅速打开胸腔，分离并取出胸主动脉和腹主动脉，置含D-Hanks液的培养皿中，尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织，然后用D-Hanks液多次冲洗血管外表及血管管腔内的凝血，再放入新装有D-Hanks的溶液中。 b纵何剪开血管，反复冲洗干净血管内壁后，在另一无菌大培皿中，滴加薄薄一层0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液，将主动脉内膜面朝下铺在酶混合液之上。在37条件下，让内膜与酶溶液充分接触并消化1020min，再加入含少量20%小牛血清的M199培养液，以终止酶的作用。 c把上述主动脉移至另一无菌培养皿，用小手术刀轻轻将内皮刮下。先顺向有次
7、序地刮内膜12次，然后再横向刮12次，用M199液将内皮细胞收集到离心管中，以1000r/min离心710min，去上清，用20%小牛血清M199培养液重新悬浮细胞备用。 2.2.4 机械刮脱法血管内皮细胞的分离取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露，再用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞，刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘，刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心710min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M19
8、9培养液中备用。2.2.5 还有微血管内皮细胞的分离及干贴法分离EC等，但较少用。2.3 EC原代培养及传代培养2.3.1 原代培养 将分离好备用的EC用含100 U/ml青霉素和100g/ml链霉素以及20%小牛血清的M199培养液（M199完全培养液）调整细胞浓度为1.52.0105/ml，接种到以0.1%纤连蛋白或1%明胶包被已干燥的平皿或培养瓶中。放37、5% CO2和饱和湿度的孵育箱中培养。24h后弃去培养液，用D-Hanks液淋洗1次，以去除未贴壁或死亡的细胞，换入等量的M199完全培养液，继续孵育箱中培养。每23d换M199完全培养液1次，换液时将原培养液弃掉1/22/3，然后加
9、入新鲜的M199完全培养液至原来的量，67d后细胞可融合成单层内皮细胞，即可传代。2.3.2 传代培养2.3.2.1 待原代培养细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hanks液淋洗2次，加入终浓度0.125%胰蛋白酶、0.01% EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞复盖，室温下（2025）消化12min。2.3.2.2 镜下见细胞稍收缩变圆，细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻洗1次或直接加入新鲜M199完全培养液后，用吸水管（滴管）将细胞轻轻吹打下来，按12或13的比例传代。2.3.2.3 每隔23d换液1次，每次换掉2/3量，待细胞长至融合状态后，
10、再次传代。2.4 观察结果用酶消化进行的原代培养，从动脉内膜上消化收集下来的内皮细胞，30min后即开始贴壁，呈扁平短梭形或多角形分散生长；46h后大部分细胞已贴壁，并开始生长，分裂，24h后形成数量不等的细胞群，约67d融合成片。传代培养的EC，10min后贴壁，57d融合成单层。2.5 内皮细胞的鉴定2.5.1 光镜检查 在倒置相差显微镜下可观察到活细胞呈扁平的短梭形或多角形，大小均匀，胞核清晰，呈卵圆形。有核的区域较无核的区域突出，细胞呈单层“鹅卵石样”或“铺路石样”镶嵌排列。2.5.2 透射电镜检查 经切片技术处理后可观察到具有特征性的细胞器（webel-palade，W-P小体），但
11、兔及猪的EC无W-P小体。2.5.3 第因子相关抗原免疫荧光检测 EC用PBS冲洗干净，放入乙醇和丙酮（11）溶液中固定10min，空气晾干，加入第因子相关抗原抗血清（兔抗人因子相关抗原抗血清），37孵育60min。用PBS冲洗干净，晾干后加第一动物IgG荧光抗体（羊抗兔IgG荧光抗体），37孵育30min。PBS冲洗干净，晾干，最后用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下观察到EC的胞浆内呈显较强的黄绿色荧光，是鉴定体外培养EC最可靠的标志。因第因子只存在于内皮细胞、巨核细胞和血小板中，其它细胞无第因子，但培养的猪主动脉内皮细胞也无此因子。2.6 注意事项2.6.1 接种材料的制备 血管取材的离体时间
12、不宜过长，一般不超过6h，万一不能当时培养，则应放置4下保存（但不应超过24h），血管内、外表面的血迹必须充分洗净，以免残留的RBC及血液中某些因子影响EC的贴壁或生长。2.6.2 酶消化液浓度的选择 0.1%（型）胶原酶溶液，0.25%胰蛋白酶溶液，0.25%胰蛋白酶0.02% EDTA混合消化液，0.125%胰蛋白酶0.01% EDTA混合消化液（常用于传代），根据实验情况选定。掌握好酶液的消化时间是内皮细胞存活的关键（原代培养）。2.6.3 杂细胞的排除 细胞传代时，加入酶消化液之后，置显微镜下观察，12min即可见大部分EC收缩变圆，而杂细胞（主要是成纤维细胞）仍然贴壁。此时，立即加入
13、M199完全培养液以终止酶的活性，然后弃去其液体，加新鲜M199完全培养液，轻轻将细胞吹打下来，传到另一培养瓶，如此经过23次，可得到较纯的EC。其次有人使用含肝素的完全培养液（在液体中加入90U/ml的肝素）可使EC纯度提高。2.6.4 EC的培养条件EC培养条件要求比较严格，培养液的pH温度，抗生素的种类和含量，血清质量和活性，ECGF的质量和含量，EC分离时所受到的创伤，孵育箱的培养条件，都对EC的生长有重要影响。2.6.4.1 小牛或胎牛血清的质量对EC的生长影响很大，胎牛血清较小牛血清更好。一般原代培养用20%，传代培养用10%血清，常用培养基为M199，pH 7.2为宜。2.6.4
14、.2 塑料培养瓶或皿较玻璃或皿更利于EC生长，培养瓶或皿铺上纤连蛋白，明胶或胶原，以利EC的贴壁生长，但应首选纤连蛋白，因它对蛋白和DNA的测定无显著影响。2.6.4.3 EC的传代培养一般EC的传代比例是12或13。如需要单次传代，扩大体外培养规模时，可以120以上的比例进行传代，这样可在短期内获得大量的EC，进行冻存或实验工作，但单次传代，扩大体外培养规模，须在培养液中加入内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF），只是该因子价格较昂贵。EC经多次传代后其形态和生物学特性会有所改变，并且其生长期有限，不断衰退，故不宜作长期传代培养，一般生长期
15、在2030d左右，如实验需要可重复从原代建立培养。体外培养EC用于评价抗动脉粥样硬化的药效学实验 现介绍几种常用的实验方法 1保护血管内皮细胞（endothelial cells，EC）药的实验损伤学说认为，机械、化学、免疫、感染等引起EC损伤是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的起始因素，反复的EC损伤引起单核巨噬细胞、血小板粘附，可致AS斑块形成。对血管内皮具有保护作用的药物可使EC免受有害因子的损伤，可能有抗AS作用。1.1原理 将EC置于适宜的培养液中进行培养，将EC以缺氧，损伤剂造成细胞损伤，通过形态学、功能、生长等指标观察药物抗损伤效应。1.2实验方案 取传代后制成单细胞悬液的EC，用含10%小牛血清的M199液调细胞至2105/ml，接种入用0.1%纤连蛋白包被的96孔（100 l/孔）或24孔（0.5ml/孔）板中培养，待细胞融合即可进行实验。通常设：正常组（不加药，不加损伤剂）；损伤组（不加药只加损伤剂）；若干给药组（加不同剂量药物，加损伤剂，或不加损伤剂）。给药组细胞首先给含药M199液，培养数h（一般624h），使药物与细胞充分作用，然后用Hanks液洗去全部药液，加损伤剂。1.2.1 多聚阳离子损伤加入含多聚赖氨酸
