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1、集美大学生物工程学院 酵母表达系统及其应用酵母表达系统及其应用集美大学生物工程学院 2011级研究生 微生物专业陈丽娜 学号：2011227006摘要 酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质。与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统操作简便，成本低廉，可大规模进行发酵，是表达真核基因产物的制备工具，越来越受到了人们的青睐。关键词 酵母表达系统 基因 外源表达 应用Yeast Expression Systems and its ApplicationBiological Engineering College of
2、Jimei University Lina Chen Student Number : 2011227006 Abstract Yeast expression system is a powerful tool that used to research and analyse the expression of eukaryotic protein. It has the function on processing and modifying after transcription so that it suits to express exogenous functional prot
3、ein stably. Compared with insects expression system and mammals expression system, yeast expression system is easy and simple to handle, much cheaper so it can be performed in large fermentation and it is a preparation tool on expressing eukaryotic gene. It gets more and more favour of people.Keywor
4、ds Yeast expression system gene foreign expression application引言随着基因组研究迅速发展，越来越多的新基因被克隆和分离，基因功能的研究已成为 21 世纪生命科学领域中的重大课题。基因表达技术是基因工程技术的核心1。分子生物学技术的发展为利用生物反应器生产外源蛋白提供了许多方法和手段。到目前为止，已发展出了大肠杆菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞等多种蛋白表达系统，其中酵母表达系统是最近发展起来的新型表达系统。酵母，一般是指以芽殖为主，形态结构简单的一类真菌。主要分布于子囊菌亚门、担子菌亚门和半知菌亚门。随着分子生物学技术的发展，利用微生物
5、表达系统生产外源基因产物已成为可能2。酵母作为单细胞真核生物，具有操作简单，可表达真核基因产物等优点，越来越受到了人们的青睐，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。1. 酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中
6、的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用2,3。酵母是单细胞低等真核生物，因而其表达系统兼有上面两种表达系统的优势：一是，酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。二是，酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生
7、物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化4。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益。2. 常用酵母表达系统酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称，主要有巴氏毕赤酵母(Pichiapastoris，Pichiamethanolica)、乳
8、酸克鲁维亚酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、烷烃利用型耶鲁酵母(Yarrowia lipolytica) 等属酵母。近年来，甲醇酵母资源引起人们的强烈兴趣，其中尤以 Pichia pastoris 使用最多、最广泛，已被认为最具有发展前景的异源蛋白生产工具之一1。2. 1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统6,7酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的 “大肠杆菌”。它是最早应用于酵母基因克隆和表达
9、的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。2.1.1 用于酵母基因表达的载体2.1.1.1 YIp（yeast integration plasmid）型载体这是一种整合型载体，如 Yip5.它不含酵母的DNA复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，含有整合介导区，此载体整合到染色体上，稳定性高，缺点为拷贝数低，但采取一些措施可以初步解决这个限制问题。第1个策略：用酵母转座子以产生多个插入拷贝；第2个策略：将re-DNA插入到核糖体DNA（rDNA）簇中， 在宿主的X2号染色体
10、上以150串联重复序列存在。用特殊的质粒如 pMIRY2转化可产生上百个整合拷贝，整合的pMIRY2在无选择压力下分裂时保持稳定。2.1.1.2 YEp（yeast episomal plasmid）型载体这是一种附加型载体， 如Yep13，它含有酿酒酵母2质粒DNA复制有关的部分或全部序列。该载体常以30或更多拷贝存在，但不稳定。它能独立于酵母染色体之外复制，为穿梭质粒（E.coli和S.cervisiae）。为了克服这些载体的不稳定性，以脆弱的srbl-1突变的宿主株为基础建立自然选择系统。这个菌株要求渗透压稳定，否则会裂解，转化后带野生型SRB的自主复制YEp型质粒与此菌株进行互补，便可
11、在培养基上保持选择性8。2.1.1.3 YCp(yeast centromeric plasmid)型载体和酵母附加型载体YEp一样含有酵母菌中的自主复制序列ARS，ARS序列中含有酵母菌染色体DNA上与染色体均匀分配有关的序列CEN，能够提高转化效率。YCp质粒携带有染色体着丝粒，这与质粒和细胞纺锤体的联合作用有很大关系，且能使自复制的质粒只有一个。YCp质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有1-5个7。2.1.2 用于基因表达的宿主菌酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，
12、仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于 30 kD 的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有 30 个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含 ARS，必需整合
13、到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2 ( for multiple integration into ribosomalDNA in yeast ) 质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA 簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2 质粒可以得到100 个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有 40 个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端-1，3-甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)
14、。2. 2 甲醇营养型酵母表达系统 甲醇营养型酵母包括汉逊酵母属 (Hansenula )，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶(AOX1)、二羟丙酮合成酶 (DHAS)、 甲酸脱氢酶(FMD)等。AOX1的甲醇诱导表达量可占到胞内总蛋白质的20 %30 %，表明 AOX1 的合成受转录水平的调控，AOX1 启动子( PAOX1)具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控3。2.2.1 汉逊酵母表达系统2 是一种极为理想的外源基因表达系统，它具有很多特殊的优点 是一种耐热酵
15、母，最适生长温度为37-43，最高生长温度可达49，生长范围较宽，易于操作控制。内含有特殊的甲醇代谢途径，含甲醇氧化酶（MOX）、甲醇脱氢酶（FMD）和二经丙酮合成酶（DHAS）几种特殊的酶；甲醇代谢途径关键酶的表达受阻遏/解阻遏机制调控，乙醇、高浓度的甘油和葡萄糖阻遏基因表达，甲醇、低浓度的甘油和葡萄糖解除阻遏。此酵母中MOX、DHAS和过氧化物酶贮存于过氧化物酶体，表达外源蛋白时可以在外源蛋白C末端加上一固定氨基酸序列：S/A/C-K/R/H-L，从而将其定位于过氧化物酶体，避免对细胞产生毒害且免受蛋白酶降解。此酵母目前已构建了多种营养缺陷株：ura3、his3、leu2、trp3和ade
16、11等，筛选方便。可以通过非同源重组整合多拷贝基因，拷贝数可达100以上，也可通过同源重组，利用葡萄糖/胆碱或葡萄糖/甲醇/硫酸铵完成表达。2.2.2 巴斯德毕赤酵母表达系统甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统最为常用，它由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71和 MC100-34。毕赤酵母表达载体都是穿梭载体，主要有三大类，Original pichia表达载体，Easyselect pichia表达载体，Multi-copy pichia表达载体。毕赤酵母表达载体具有胞内分泌和胞外分泌之别，一般应用胞外分泌型载体。而且该载体还有自
