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1、支气管肺泡灌洗(BAL) 操作方法：一、术前准备同纤维支气管镜(纤支镜) 术前准备,常规在纤支镜气道检查后于活检刷检前做BAL。局部麻醉剂为2 %利多卡因。二、BAL 操作技术1.灌洗部位选择:对弥漫性间质性肺疾病选择右肺中叶(B1或B5 ) 或左肺舌段，局限性肺病变则在相应支气管肺段进行BAL2. BAL 操作步骤首先在要灌洗的肺段经活检孔通过一细硅管注入2 %利多卡因12ml ,做灌洗肺段局部麻醉然后将纤支镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处,再经活检孔通过硅胶管快速注入37 灭菌生理盐水,每次2550ml ,总量100250ml ,一般不超过300ml立即用50 100mmHg(1mmHg
2、 = 0. 133kPa) 负压吸引回收灌洗液, 通常回收率为40 %60 %将回收液体立即用双层无菌纱布过滤除去粘液,并记录总量装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞粘附) ,置于含有冰块的保温瓶中,立即送往实验室检查支气管肺泡灌洗液(BALF) 实验室检查一、BALF 细胞总数和分类计数检测1.将上述回收灌洗液装入塑料离心管内, 在4 下以1 200r/ min 离心10min ,上清(原液或10 倍浓缩) - 70 储存,用做可溶性成分的检测。2. 经离心沉淀的细胞成分用Hanks液(不含Ca2+ 、Mg2+ ) 在同样条件离心冲洗2 次, 每次5min。弃去上清后Hanks 液35
3、ml 制成细胞悬液。也可以应用灌洗原液以减少细胞丢失3. 在改良的Neubauer 计数台上计数BALF 中细胞总数,一般以1 109/ L表示。如果细胞数过高时,再用Hanks液稀释,调整细胞数为5 109/ L ,并同时将试管浸入碎冰块中备用4. 细胞分类计数:采用细胞离心涂片装置,加入备用细胞悬液(细胞浓度为5 109/ L) 100l ,在4 下以1 200 r/min 离心10 min通过离心作用将一定数量的BALF 细胞直接平于载玻片上。取下载玻片立即用冷风吹干,置于无水乙醇中固定30 min 后进行染色,一般用Wright 或HE 染色RPMI 1640 培养液35ml 制成细胞
4、悬液2. 将细胞悬液倒人平皿中,置于37 5 %CO2 培养箱中孵育2h ,进行贴壁处理,去除肺泡巨噬细胞3. 取出细胞悬液,再用Hanks 液冲洗离心1 次,弃上清留20100l 。经贴壁处理后的细胞悬液中,肺泡巨噬细胞显著减少,淋巴细胞相对增多4. 将经贴壁处理的细胞悬液分装3个小锥 形离心管内,每管2030l ,用微量加样器向标本中加单克隆抗体CD3 ,CD4 和CD8 各2040l ,混匀置于4 冰箱中作用12h5. 取出标本,先用Hanks 液冲洗离心2 次,以12 000 r/ min 离心20s ,然后加羊抗鼠荧光抗体各2040l ,置于4 冰箱作用30min。6. 取出标本用H
5、anks 液以同样速度和时间离心冲洗2 次,弃上清留20l充分混匀细胞,取1 滴于载玻片上加盖玻片。荧光显微镜下数200 个淋巴细胞并计算出标有荧光细胞的阳性率几点说明1. 用于做支气管肺泡灌洗的纤支镜顶端直径应在5. 56. 0mm 左右,适于紧密楔人段或亚段支气管管口,防止大气道分泌物混入和灌洗液外溢,保证BALF 回收量2. 在灌洗过程中咳嗽反射必须得到充分的抑制,否则易引起支气管壁粘膜损伤而造成灌洗液的混血,同时影响回收量3. 一份合格的BALF 标本应是:BALF 中没有大气道分泌物混入;回收率 40 % ,存活细胞占95 %以上;红细胞 10 %(除外创伤/ 出血因素) ,上皮细胞
6、 3 %5 %;涂片细胞形态完整,无变形,分布均匀4. 由于BALF 中可溶性成分检测受诸多检测因素影响,如灌注量和回收量、肺泡上皮通透性等,致使肺泡衬液稀释度亦有所不同。尽管在做BALF 可溶性成分检测时采用内或外标记物进行标化,但检测结果仍存在着差异,其 临床价值有限, 故本草案未做有关BALF 液性成分检测方法的规范5. 本规范不适于少量液体做支气管冲洗(BL) 和全肺灌洗技术的操作。6. 健康非吸烟者BALF 细胞学检测正常参考值: (1) 细胞总分数:细胞总数(0. 90. 26) 109/ L ,其中肺泡巨噬细胞0. 93 0. 03 ,淋巴细胞0. 07 0. 01 ,中性和嗜酸
7、细胞均TTHTSh ：Sb 细胞Yamada19862513863045425319053Wallaert1987127766448427518?/FONT三、可溶性物质检查BALF离心液的上清液中含有复杂的可溶性成份，例如各种蛋质、酶类、脂类等（表13-3）。这些成分的来源有：被动漏出者（如白蛋白、血清类粘蛋白）；主动转运者；局部产生分泌成分。这些物质反映肺泡表面衬液成份，其测定对了解某些肺部疾病的病变特征，研究发病机制提供重要手段。表13-3 BALF检测的可溶性物质全屏显示表格 溶质浓度近似值溶质浓度近似值总蛋白70g/ml纤维连接蛋白30-150ng/ml白蛋白70g/ml白细胞弹性蛋
8、白酶+免疫球蛋白胶原酶+IGG2.5-10g/ml血管紧张素转换酶+IGA2.5-6g/ml极性脂质78g/mlIGM100ng/ml非极性脂质45g/mlIGE0.06-0.3g/ml前列腺素E200-2000pg/ml1-抗胰蛋白酶1-2g/ml血栓素B25-85pg/ml2-巨球蛋白0.04g/ml癌胚抗原0.8ng/ml转铁蛋白4g/ml四、微生物学检查1涂片BALF不像痰液那样易受上呼吸道杂菌的污染，也不含气管和左右支气利害的分泌物，含非病原性阿菌很少，故其涂片检菌的意义较大取BALF沉淀物进行本兰氏染色与抗酸染色检查，对结核分支杆菌的检查有较大意义。2培养：严格无菌操作采BALF进
9、行增菌培养或取其沉淀物直接分离培养，是检查支气管和肺部感染的重要方法，不仅适用于对细菌和真菌等检查，也适用于对支原体的培养和病毒分离，当培养的细菌105CGU/ml时被认为有诊断意义。但标本采集方法复杂。五、寄生虫学检查1卡氏肺孢子虫：人类般受感染后无明显症状。但若患者的免疫功能低下，特别是AIDS患者和大量使用免疫抑制剂的患者易受感染，并可引起严重的间质性肺炎。于患者痰中不易查到寄生虫，而BALF沉淀物检出的阳性率较高。2卫氏并殖吸虫卵：轻型肺吸虫病患者痰中可能查不到虫卵，而可从BALF沉淀物中查到。除以上各项检查外，还可检查BALf 中有无其它异特。若在BALf 沉淀物中查到石棉小体，有助
10、石棉肺的诊断。六、临床应用由于BAl 能获取肺泡表面衬液，因此对其内容物的检查有助于肺部疾病的诊断、治疗、预后判断及发病机制研究。其应用范围越来越广，此处钗做重点介绍：1肺部感染的病原学诊断：BAL检查在下呼吸道感染的检查中占有重要的地位。BAL可以收集较大范围肺实质的肺泡表面衬液标本，可进行原虫、病毒及细菌学等检查。对于普通细菌感染者其细菌培养大于等于105cfu/ml时为确定感染的阈值。但对于某些特殊感染，如在BALF中分离出结核分支杆菌、军团菌即可做出诊断。BALF对免疫功能低下合并肺感染的诊断也很有帮助，如对巨细胞病毒感染的敏感性达96%，对肺孢子虫的感染敏感性为85-90%。2BALf 检查：诊断呼吸道原发性或继发性恶性肿瘤有较好效果，也包括周围性肺癌、弥漫性肺恶性肿瘤（如支气管肺泡癌）、小细胞肺癌等。但BALF检查结果受癌类型和肿瘤大小的影响，以腺癌和肺泡癌阳性率最高。3对间质肺疾病的诊断、治疗评价及预后提供帮助（1）外源性变应性肺泡炎：急性期BALF细胞总明显增
