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1、2022乳腺癌基因诊断技术（全文）乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺不是维持人体生命活动 的重要器官，因此原位乳腺癌并不致命，但癌细胞随血液或淋巴液播散到 全身重要脏器，那么可危及生命。虽然中国妇女乳腺癌发病率低于世界平均 水平，但增长迅速，自1990年以来其上升速率约为全球平均增长速率的 2倍。根据恶性肿瘤统计数据，乳腺癌发病率已跃居中国女性新发癌症的首位, 病死率为第6位，对广大女性身体健康造成了极大的威胁。乳腺癌的早诊 断、早发现、早治疗能提高患者的生存率，为了诊断出更早期的乳腺癌患 者，并提高诊断的准确性，基因诊断的研究越来越深入，因此，笔者就乳 腺癌基因诊断新技术进行综述。
2、一、乳腺癌早期诊断的意义和现状乳腺癌是少数几种能通过早期诊断而降低病死率的恶性肿瘤之一。工、口、 HI期乳腺癌患者的5年OS率分别为96.8%、73.7%和46.4% , 10年OS 率分别为78.7%、64.6%和33.5%。美国I期乳腺癌确诊患者占比为62% , 而中国仅有20%，仍有大量晚期乳腺癌患者，因确诊太晚而无法接受有效 的治疗。因此，防控乳腺癌的关键在于通过早期筛查及时发现乳腺癌患者，从而提 高患者的治疗效果和生活质量。但由于早期乳腺癌往往不具备典型的临床 一代测序方法并不能涵盖以上多种突变类型，而NGS检测那么可以检测 BRCA基因的全部外显子，并通过生物信息学算法完成对各种突
3、变类型的 分析。此外,美国FDA还扩大了 Myriad Genetics公司的伴随诊断检测 产品BRAC Analysis CD的适用范围,它可通过聚合酶链式反响 (polymerase chain reaction, PCR)和Sanger测序检测单核甘酸多态性 (single nucleotide polymorphism , SNP)和小片段的插入和缺失，用多 重PCR检测乳腺癌与卵巢癌患者血液样本中的BRCA1和BRCA2基因大 片段缺失和拷贝数变异，从而确定患者是否具有遗传性BRCA突变,并可 筛选出最有可能从多聚二磷酸腺甘核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymera
4、se , PARP)抑制剂利普卓(lynparza)治疗中受益的患者。美国 FDA对BRAC Analysis CD适用范围的进一步扩大，使学者们看到了伴随 诊断为乳腺癌精准治疗带来的巨大希望，但值得注意的是，目前市场上仍 缺乏专门针对乳腺癌的NGS类CD检测产品。六、结语通过NGS解析基因序列的变异对乳腺癌的诊断、预后和治疗都具有重要 作用，已有基于NGS技术对三阴性乳腺癌患者和ER阳性乳腺癌患者进行RNA测序和DNA测序56,57,这些研究结果极大地推动了乳腺癌基因组学的进展。此外，通过NGS还发现了一些除BRCA1/2以外的乳腺癌易 感基因。然而,NGS作为一种新技术还存在不少问题。比方
5、，NGS的测序结果对 于患者或临床医师是没有意义的，需要经过病理分析师将测序结果转化为 临床可以参考的结果。因此这类产品的平安性、有效性不仅要考虑产品的 测序性能，同样要考虑测序结果解读导致误判的风险。此外，鉴于大健康 概念所蕴含的巨大商机，很多商业性基因测序服务机构都开展了 NGS基因检测服务，但是基因检测服务提供方良莠不齐，其检测质量难以得到保 证。这些都需要统一的规范和严格的管理，否那么对于NGS的应用推广将 产生不利的影响。目前美国FDA等机构已对NGS的临床应用提出了一些 指南和建议，涵盖了伦理、患者教育、生物信息数据处理、数据贮存及临床报告的多个环节，这对于建立统一的质量控制标准来
6、说是一个良好的开工山炳。总而言之基于NGS技术的乳腺癌基因诊断研究已经取得了很大的成果。但目前获批上市的NGS乳腺癌诊断试剂盒仍非常少，而且价格昂贵，且 NGS的肿瘤诊断应用之路仍有不少问题需要解决。但可以预见的是，未来 随着人类对乳腺癌及其他肿瘤发生、开展机制的深入认识，以及NGS技 术的不断进步，精准医学所提出的个性化治疗终将成为可能。病症和体征，且大多数肿块为无痛性，很容易被忽视。目前常用的乳腺癌 筛查手段有MRI、乳腺X线检查和超声检查等，这些影像学辅助检查各有 优劣，在临床诊断中往往需要联合使用，增加了患者的诊断费用和时间成 本。基因诊断与常规影像学检查相比，具有明显的优势。因为先天
7、遗传因素或 者后天环境因素都参与了乳腺癌的发生、开展，其中人体遗传物质（基因） 的改变是引发乳腺癌的关键性因素之一。因此，通过研究并检测患者基因 序列的变化，能在出现典型的临床表现之前更早确实诊乳腺癌，提高癌症 防治水平。二、乳腺癌的易感基因正常乳腺上皮细胞中存在多种原癌基因（oncogene）和抑癌基因（tumor suppressor gene）,它们共同调节细胞生长的正、负平衡，使细胞的分裂 和增殖按有节制的方式进行9。当这2类基因发生质变（点突变、重组、 转位、局部或全部缺失）和量变（拷贝数增加）时，导致原癌基因活化和抑癌 基因失活，就会引发细胞生长失衡、增殖失控；当细胞增殖失控积累到
8、一 定程度时就会引发癌变10o目前原癌基因有HER-2、PIK3CA. c-myc、Int-2、Ras、hTERT、CDH1 和 ESR1 加癌基因有 TP53、BRCA1、BRCA2、BARD1、PALB2、Rb、nm23s PTEN、ATM、BRIP1、CHEK2、NBN和STK11 o其中比拟重要的基因有HER-2、磷脂酰肌醇激酶-3(phosphatidylino-sitol 3-kinase, PI3K)、c-myc、ESR1 s 肿瘤蛋白53（tumor protein 53 , TP53）、BRCA1/2 和 PALB2OHER-2是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的EGFR家族蛋白。
9、HER-2基因的致癌机制是抑制细胞凋亡，促进细胞增殖；增加肿瘤细胞的侵袭力，提 高转移风险；促进肿瘤血管新生和淋巴管新生。30%以上的人类肿瘤中存 在HER-2基因的扩增（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌 和前列腺癌等），其中20% 30%的原发浸润性乳腺癌存在HER-2基因的 扩增。目前，HER-2基因是重要的乳腺癌治疗靶点和预后指标。PI3K信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节,磷脂酰肌醇激酶-3 催化亚基4phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit a, PI3KCA）负责编码PI3K的一个催化亚基。
10、PIK3cA基因突变后可导致激酶活性增强，持续活化下游的蛋白激酶B，从而减少细胞凋亡, 导致乳腺上皮细胞和成纤维细胞的增殖和转化29,约18% 40%的乳腺癌患者中有PIK3CA基因突变。c-myc基因属于核蛋白类原癌基因。c-myc基因参与细胞凋亡的调节，它可使细胞无限增殖，获得永生化能力，与乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、 宫颈癌、视网膜母细胞瘤、成骨肉瘤等多种肿瘤的发生、开展都密切相关。约40%的乳腺癌患者有c-myc基因扩增。如果下调乳腺癌细胞系中c-myc基因的表达，那么能抑制乳腺癌细胞的增殖30。ESR1基因编码ERa该基因位于6号染色体，由配体结合、DNA结合和转录激活3个结构域组成
11、。ER嘱于类固醇激素受体超家族成员，是一种 配体依赖性转录因子，可与雌激素特异性地结合。该蛋白定位于细胞核, 可与ER0形成同源二聚体或异源二聚体。ESR1基因突变与乳腺癌转移密 切相关，在乳腺癌的发生、治疗和预防中具有重要作用。TP53基因是一种重要的抑癌基因，其编码蛋白TP53不仅可以阻止肿瘤 细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡，还可以修复正常DNA的损伤，因而被称 为人体的“基因警察。TP53也是迄今发现的与肿瘤相关性最高的基因， 其变异与许多癌症发生有关，包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、胃癌、结肠癌、 食管癌等。在乳腺癌患者中，遗传因素导致的TP53突变极少（约占1%）,而体细胞的突变更为常见（约占
12、20% 40%）。BRCA1和BRCA2都属于抑癌基因，分别位于人体的第17号和第13号染色体上，在参与DNA损伤修复、维持细胞正常生长方面具有重要作用。如果这2个基因发生了突变，那么它们所具有的肿瘤抑制功能和对细胞增 殖分化的控制能力就会受到影响，癌变的概率将明显增加21,22。已发现 的BRCA1/2的突变有数百种之多,并与乳腺癌和卵巢癌，乃至男性乳腺 癌、胰腺癌和前列腺癌的发生都密切相关,BRCA1基因突变者，患乳腺 癌和卵巢癌的风险分别是50% 85%和15% 45% ;BRCA2基因突变者, 患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50% 85%和10%20%。因此，BRCA1/2基因检测对于乳
13、腺癌和卵巢癌的患病风险评估及早期诊断都有 重要意义。PALB2基因被认为是继BRCA1/2基因之后的第3个乳腺癌关键基因,携带PALB2突变基因的女性发生乳腺癌的风险在40岁以下人群中增加7 8倍，在40 60岁人群中增加5 7倍，在60岁以上人群中增加4倍。PALB2基因的编码蛋白是抑癌基因BRCA2向细胞核内转移定位及核内稳 定的协同因子，在保持基因组稳定和调节细胞周期过程中起重要作用。当BRCA2发生错义突变时会干扰PALB2蛋白的结合，从而使BRCA2失去DNA修复的能力。三、第二代测序(NGS)与乳腺癌易感基因检测大约24%的遗传性乳腺癌或卵巢癌患者的家庭成员中能发现BRCA1/2基
14、 因突变，而在同时拥有1例乳腺癌患者和1例卵巢癌患者的家庭中，BRCA1/2基因突变的频率那么高达41.6%。但仍有很多其他基因突变可能导致乳腺癌的发生，在乳腺癌筛查中仅检测BRCA1/2基因突变是不够的。从另一方面而言，尽管多个乳腺癌易感基因都已经被鉴定，但是这些基因 中的任何1个突变都是罕见且因人而异的，如果用常规方法每次检测1个 基因既低效又昂贵，NGS时代的到来为解决这个难题提供了可能。NGS与Sanger测序(即第一代测序)技术都是基于边合成边测序或边连接 边测序的原理，但与后者相比，NGS具有通量大、精确度高和信息量丰富 等优点，可以在较短时间内对感兴趣的基因进行精确定位，可以对未
15、知的 序列进行检测，也可以对某组织在某一时间表达的mRNA进行测序。NGS 主要包括全基因组测序(whole-genome sequencing, WGS)s全外显子组测序(whole-exome sequencing, WES)以及目标区域测序(targeted region sequencing , TRS)36O以高通量为特点的NGS技术在后基因组时代蓬勃开展,有力地支持了肿瘤基因组图谱(The Cancer GenomeAtlas, TCGA)等多个肿瘤基因组工程的实施。目前，NGS已在无创产前筛查、肿瘤基因检测、遗传性疾病诊断、用药指 导、复发监测等多个临床领域得到广泛应用37,38
16、。以肿瘤的基因检测为 例，基于NGS技术，未来的癌症治疗将实现对全外显子组的3 000多个 基因进行全信号通路检测，从而可根据导致疾病的潜在分子及相关因子对 疾病进行诊断和分类，这也使得“同病异治和异病同治”的精准医学模式 成为可能。以乳腺癌为例，癌症基因组图谱已测定了 510个乳腺癌外显子 组序列，并将其分为5个内源性亚型：luminal A型、luminal B型、正 常乳腺样型、HER-2过表达型和基内幕胞样型40,41。针对不同分型的 乳腺癌可采用不同的治疗方案。随着NGS技术的飞速开展在普通人群中进行NGS检测的费用不断下降。 曾有研究利用NGS对有肿瘤家族史的人群进行肿瘤基因检测，结果显示 检测肿瘤细胞中BRCA1/2及TP53基因的特异度和敏感度均高于传统检 测方法。由于乳腺癌的发生、开展与多个基因密切相关,基于NGS的遗 传性乳腺癌基因集合(gene
