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1、微量凯氏定氮法目的1. 掌握应用微量凯氏定氮法测定样品总氮量/蛋白质的原理和方法2. 学会使用凯氏定氮仪原理凯氏（Kjeldahl）定氮法常用于测定天然有机物（如蛋白质，核酸及氮基酸等）的含氮量。 含氮有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢被分别氧化成co2和h2o,氮则转变为氨, 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵，是为“消化”。该反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾/硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸 铜作为催化剂促进反应的进行。以甘氨酸为例，其消化过程可表示如下：CH COOH + 3H SO T 2C0 t + 3SO t + 4 HO + NH T2 242223NH22 NH + H SO
2、 T （NH ） SO3 244 24浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，可借助水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量 及一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液 中的氢离子浓度降低；然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最 后根据所用标准酸的当量数（相当于待测物中氨的当量数）即可计算出待测样品中的氮含量。（NH4） SO + 2NaOH T Na SO + 2NH OH24244NH OH T H O + NH3t42NH + H BO T NH H BO333423NH H BO + HCL T NH CL + H BO4 23433滴定
3、时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.25.6，将NH4H2BO3的蓝/ 绿色滴至原来H3BO3的蓝紫色即为终点。本法适用范围0.2l.Omg氮，相对误差应小于2%。材料、试剂与器具材料鱼肉、血清等含蛋白质样品试剂1. 浓硫酸 （ 化学纯）2. 30%氢氧化钠（分析纯）溶液3. 硫酸钾-硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜以3:1 （W/W）配比混合研磨成粉末4. 混合指示剂：0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml与0.1%甲基红乙醇溶液200ml混合配成（贮 于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏）5. 0.0500M Hcl6.硼酸-指示剂混合液：2%硼酸溶液10
4、0m 1,滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈 现紫红色即可（约加 1ml 左右混合指示剂）。器具凯氏烧瓶消化架吸量管（1ml, 2ml） 量筒（10ml） 凯氏定氮蒸馏装置 微量滴定管（3ml, 5ml,可读至0.02ml） 锥形瓶（50100ml） 容量瓶（50ml）操作步骤 消化称取适量鱼肉样品加入50ml凯氏烧瓶（注意勿沾于瓶口或瓶颈上）。加入硫酸钾-硫酸铜混合物约0.2克，浓硫酸3ml,小瓷片两粒，摇匀。将烧瓶约60度 角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。在消化开始时，应控制火力，不要使沸液冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解 并放出SO2白烟后，适当加强火力
5、，继续消化，直至消化液呈透明蓝绿色为止。消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10ml （注意慢加，边加边摇）。冷却后将瓶 内容物转入 50ml 容量瓶，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度 摇匀，做上记号备用。 蒸馏1、仪器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。 蒸馏器有几种，应用前需熟悉其使用方法。使用方法如下：图 1-1 凯氏微量定氮蒸馏装置开放自来水龙头，使水E进入G,从K管流出（水不宜开得过大以免水从G管溢出）。 开放P3，使水进入A室，漏斗D中加蒸馏水约10ml入B室。用拇指将管口按紧，同时开放P,则B室中的水先从Y型管口冲出，随后A室中水经K管流出，一般
6、情况下如此重复 洗涤两次即可。若蒸馏器内有氨存在，则应加入蒸馏水后，不加样品蒸馏一次方可使用（可 用 pH 试纸检查）。A为蒸气发生室，P3为其开关，P为出水开关，B为蒸馏室，与出气管M相接，M管 插入盛有定量硼酸液的锥形瓶，B室内有Y型管，一端与A室相通，另一端经P4与漏斗D 相连，可经此将样品及试剂加入B室，F为冷凝管，E为进水管，水经F、G、K而流出， 蒸馏时依次在B室加入消化好的样品及NaOH,二者反应产生氨，经M管进入锥形瓶由硼 酸吸收。2、空白蒸馏：蒸馏器洗净后，开放水龙头P3，使水进入A室，水放至A室球部2/3即可。 取1个50ml锥形瓶，准确加入10ml硼酸-指示剂混合液，用表
7、面皿复盖备用。 加样：用移液管吸取 1ml 蒸馏水，细心地由漏斗 D 倾入蒸馏室。将盛有硼酸-指示剂的锥形瓶置于M管下，使管口恰好接触硼酸溶液。用量筒从漏斗D加入30%氢氧化钠8ml,随即将P4夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封 闭（水封）。蒸馏：用酒精灯加热 （注意防风以维持火力恒定 ），待硼酸-指示剂变绿时开始计时； 35min后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸馏2min,最后用蒸馏水冲洗导管外壁。蒸馏完毕后取下锥形瓶，撤火，随即将蒸馏器洗净。3、样品蒸馏：用移液管分别吸取两份1ml样品消化液，按上述操作步骤进行蒸馏（注意 在加样后应用适量蒸馏水清洗漏斗）。滴定：用0.0500N标准盐酸溶液滴
8、定蒸馏吸收液至淡紫色或灰色，记录所用盐酸的量。 计算样品的总氮含量（克氮）=(A B X 0.0100 X14C x 1000X100若测定的样品含氮量部分只是蛋白性， （如血清）则：样品的总蛋白含量（克蛋白%）=(A B) x 0.0100 x 14 x 6.25C x 1000x100式中：A为滴定样品用去的盐酸平均毫升数；B为滴定空白用去的盐酸平均毫升数；C 为称量样品的克数； 0.0100为盐酸的当量浓度（应为本实验使用盐酸的实际浓度）； 14为氮的 原子量； 6.25 为常数。若样品中除有蛋白外，尚有其他含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要更复杂一些。 首先需向样品中加入适量的三氯乙酸
9、（使蛋白质变性沉淀），然后测定未加三氯乙酸的样品总 氮及加入三氯乙酸后的样品上清液中的非蛋白氮，再进一步算出蛋白质的含量。蛋白氮=总氮非蛋白氮蛋白质含量（克/%）=蛋白氮X 6.25注意事项1、凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样 品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。其缺点是操作比较复杂，含有大量碱性氨基 酸的蛋白质测定结果偏高。2、普通实验室中的空气中常含有少量的氨，会影响结果，所以操作应在单独洁净的房 间中进行，并尽可能快地对硼酸吸收液进行滴定。3、蒸馏时需控制火力以避免样液倒吸。 实验报告绘画蒸馏装置图，计算待测样品的总氮量和蛋白质含量 思考题1、写出以下各步的化学反应方程式：蛋白质消化；氨的蒸馏；氨的滴定2使用本测定法时产生误差的可能原因有哪些？
