实验二 琼脂糖凝胶电泳

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1、实验二：琼脂糖凝胶电泳【实验目的】学习和掌握琼脂糖凝胶电泳方法。【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作; 2.获得完整实验图谱。一、实验原理：琼脂糖是一种线性多糖聚合物，系从红色海藻产物琼脂中提取而来的。经化学修饰成低熔点（LMP）琼脂糖，熔点6265C。凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关（表2-1）。表21琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖5000010000.7%琼脂糖2000010001.4%琼脂糖60003004.0%聚丙烯酰胺100010010.0%聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺501D

2、NA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液 中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应, 即 DNA 分子本身的大小和构型。凝胶电泳中，加入溴化乙锭（ethidium bromide, EB ）染料（灵敏度可达0.05“）对核酸分子染色紫外光下检测。由于溴化乙锭分子的插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便 呈现桔黄色的荧光，便于鉴定，可对DNA片段做出鉴定。atmlfinglhgel,iX.7Vfcfn45rrin二、药品试剂及耗材1. 50X TAE 缓冲液 500 ml2. 琼脂糖3.

3、10mg/ml EB4. 久DNA/Hind III markers5. 薄膜手套，透明胶布三、实验步骤（一）制备30ml 0.8%琼脂糖凝胶1、将50XTAE稀释成1XTAE,称取0.24g琼脂糖粉末加入30ml 1XTAE中，在微波炉中加热lmin 至琼脂糖溶解。2、待溶液冷却至50C60C左右，加入1.5ul EB （10mg/ml）至终浓度0.5ug/ml，充分混匀。（二）胶板的制备1 、取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用透明胶封固玻璃板两头。2、将冷却到50C60C的琼脂糖胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，胶面平整，避免形成气泡，凝胶 厚度为35mm之间，插上样品梳。3、待胶凝固后，除去封带，

4、拔出梳子，放入加有足够1XTAE电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出 凝胶表面约 1mm。（三）加样1、制备DNA上样液：取5uL DNA+1 uL上样缓冲液（即DNA： loading buffer= 5： 1）混匀（即离 心 4000rr/min,20s）。2、用移液枪小心地将上样液垂直地加入加样孔，并记录点样顺序。每加完一个样品，换一个加样头， 加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约5 uL。（四）电泳1、接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极），正极为红线，采用 80100V 电压。2、溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后切断电泳，取出玻璃板，在紫外灯下观察凝胶。3、洗净电泳槽和梳子，晾干。补充：0.8%的琼脂糖凝胶能很好地分辨 1-25kb 的片段；0.5% 的琼脂糖凝胶用于分辨较大片段的 DNA （20100kb）；对于小片段的DNA（0.22kb）可用1.5%或更高浓度的凝胶进行分离。上凝胶加样缓冲液（loading buffer）的功能主要有两个。第一，溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用, 显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE， 从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。