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1、琼胶酶的生产工艺班级：09生工1班 学号：48 姓名：纪伟前言 琼胶是一种从江蓠、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，琼胶糖是由1,3 连接的-D-半乳吡喃糖和1,4 连接的3,6-内醚-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。硫琼胶结构较复杂，含有D-半乳糖、3,6-半乳糖酐、半乳糖醛酸和硫酸基，丙酮酸1。琼胶酶能降解琼胶多糖，生成琼胶低聚糖，这些降解产物在食品领域均有良好的应用前景。而且，琼胶酶在PCR 产物回收等方面也极具应用价值。近年来随着糖生物研究及低聚糖制备技术的不断发展，低聚糖的巨大潜力受到越来越多的关注，及功能性食品、新化工品等研究的热点。虽
2、然琼胶低聚糖的研究还远落后于肝素等糖类，但韩国、日本已对琼胶酶及其水解产物的生物活性功能已有一定的研究，证明了一定聚合度的琼胶低聚糖具有重要的应用价值和开发前景6。由此看来，开展琼胶酶的研究具有一定的科学意义和社会效益。在本实验中介绍从海水中分离到一株高产琼胶酶-短杆菌（Brevibacterium sp）的海洋革兰氏阳性菌的植被流程。1 材料与方法1.1 培养基及试剂 2216E 海洋细菌培养基 基础培养基（g/L ）：NaCl 25 ，NH4Cl 10 ，MgSO4.7H2O 5，KCL 10，FeSO4.7H2O 0.02， CaCl2 0.2，NaH2PO4 0.6，琼脂 1，pH 7
3、.0；DNS 试剂:见文献4；0.2M 磷酸缓冲液1.2 取样及处理方法 用无菌容器取海水，再用无菌海 水稀释后涂布平板，27恒温培养。1.3 初筛和复筛 平板培养48h 后，取出观察，含琼胶酶的菌株的菌落周围会出现明显的凹陷。选取凹陷明显的菌株，2216E 海水琼脂平板划线分离纯化。初筛分离纯化得到的菌株，平板培养48h 后用卢戈氏碘液染色观察。琼胶平板可以被降解，能够产生琼胶酶的细菌，由于菌落周围琼胶被降解,降解后的琼胶不能着色，因此其菌落周围会产生水解圈(透明圈)。1.4 菌种保藏 液氮保藏法1.5 粗酶液的制备取纯化的菌种接入琼胶培养基于22摇床培养16h，所得的培养液经4、5000r
4、/min离心30min，收集上清液作为粗酶液用于酶活的测定。1.6 酶活测定 在粗酶液中加入磷酸缓冲液（pH 值7.2,体积为所用液体培养基体体积的50），然后取1ml，加入0.8的琼胶糖溶液1ml，55酶解30min 后于沸水浴中灭活，加入DNS 试剂，在沸水浴中保温7min 显色。显色后的溶液经20、2000r/min 离心5min，取上清液稀释用紫外可见光光度计于540nm 处测OD 值，以煮沸灭活酶液为对照。以每分钟吸光度增加0.001 为一个酶活（U）。2 酶的分离纯化2.1 硫酸铵盐析发酵上清液中加入硫酸铵粉末至0% 90% 饱和度，4静置过夜，6000 r /min 冷冻离心30
5、 min 收集沉淀，用少量冷却的磷酸盐缓冲液溶解，置于透析袋中透析除盐。测定不同区间透析液的酶活力和蛋白质含量，计算酶的比活力，由此确定此琼胶酶分段盐析适宜的硫酸铵的饱和度。2.2 DEAE 阴离子交换层析透析后所得酶液上样于DEAE 阴离子交换柱，用0 0 8 mol /L NaCl 梯度洗脱，流速约为0 5 mL /min，检测波长为280nm，洗脱液分部收集( 4 5 mL /管) 。测定洗脱管峰部分的试管中溶液的酶活力，将有活性的部分合并。2.3 葡聚糖凝胶G-100 凝胶过滤层析将2.2得到的酶液上样于20mmol /L( pH7 2)Tris-HCl 平衡的葡聚糖凝胶G-100 凝
6、胶柱并洗脱，控制流速为0 5 mL /min。洗脱液经紫外检测并分部收集( 4 5 mL /管) ，分别测定出峰部分试管的酶活力，将有活性的部分合并。3 讨论海洋微生物生产琼胶酶已有报道，1902 年Groleau首次从海水中分离到能分解琼胶的细菌琼胶假单胞菌。从那以后，人们已经从海水系统中分离到了多种琼胶分解菌1，包括Pseudomonas(假单胞菌属)、Pseudoalteromonsa(假别单胞菌属)、Streptomyces(链霉菌属)、Alteromonas(别单胞菌属)、Microscilla、Vibrio(弧菌属)、Cytophaga(噬细胞菌属)等8。它们均是革兰氏阴性菌，而海
7、洋革兰氏阳性菌生产该酶的报道似乎仍尚未见。不同的菌产生的琼胶酶特性不同，而革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌所产的酶在底物专一性、酶解产物等方面可能有更大的差异9。因此，研究革兰氏阳性细菌的琼胶酶的性质及底物特异性等，对于获得不同的活性寡糖成分具有重要意义。本研究从海洋环境中筛选具有高效产生琼胶酶能力的革兰氏阳性菌株，并通过16S rRNA 基因序列的测定，确定该菌为短杆菌（Brevibacterium linens）。并通过产酶条件的优化，将其所产琼胶酶酶活提高了50多倍。本工作的开展，为进一步研究琼胶酶酶解产物的生理活性、我国海藻资源的高值化利用提供了必要的基础。3 短杆菌生产发酵琼胶酶工艺总流程
8、图保藏菌种 发酵液 板框压泸 滤液 粗滤 精滤 超滤浓缩 吸附 烘干 磨粉 粉剂成品 液体酶成品 图 琼胶酶生产流程图参考文献1 王静雪，江晓路等. 细菌降解琼胶的研究进展J. 中国水产科学,2001,8(3):9495.2 褚燕，于文功等. 琼胶酶高产海洋假单胞菌CY24 的筛选及培养条件优化J.中国海洋药物， 2003,(5)：14.3 王志，蔡俊鹏，徐丽. 九孔鲍肠道中产酶菌株的筛选及其与深圳湾菌株的比较J.粮食与饲料工 业，2004, (5):3436.4 张信旭、高海波. 3，5二硝基水杨酸测定古尼虫草中多糖含量方法J. 贵州化工，2002，27（3）：23385 林加涵，魏文铃.
9、现代生物学实验M.上册.6 Jean H. Erasmus, 1997. The role of bacteria in the digestionof seaweed by the ablone HaliotisJ. Aquaculture 155,377-386.7 顾燕松. 纺织生物助剂果胶酶酶活的测定方法J. 纺织科学研究，2002，3：2935.8 Qhta Y, Nogi Y, et al. Enzymatic Properties and Nucleotideand Amino Acid Sequences of a Thermostable -agarasefrom the Novel Marine Isolate,JAMB-A94J. Biosci.Biotechnol. Biochem, 2004,68(5):19731081. 2011年9月11日
