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1、估计你的福林酚浓度存在问题，导致显色反应不充分。建议在检测前标定你的福林酚。方法：取福林酚（相当于一元酸）1.0ml，精密移取，加水100ml，加酚酞指示剂数滴，用 0.1mol/LNaOH 滴定，按滴定体积对福林酚浓度进行换算。药典方法配制的浓度为 2.0mol/L。http:/ 冻干制剂以甘露醇做骨架测多肽含量，制剂用同浓度甘露醇液做空白测吸光度后，按原方法 标准曲线计算即可。http:/ 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙 的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理 与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种
2、试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而 提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白 质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐一磷钨酸盐被蛋白质中的酪 氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深 度与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得 到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长， 要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对 双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干
3、扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿 素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%）， 丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的 溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅， 则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时，加F olin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上 述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜一
4、蛋白质溶液中时， 必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。 此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20250mg。（二）试剂与器材1. 试剂（ 1 ）试剂甲：（A）10克Na2CO3, 2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O）。溶解于 500 毫升蒸馏水中。（B）0.5克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A） 与1份（B）混合，即为试剂甲。（ 2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4 2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4 2H
5、2O） 及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85% 磷酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以 小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4）, 50毫升蒸馏水及数滴液 体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再 重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。（ 3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。牛血清清 蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % N
6、aC 1溶液。2. 器材（1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器 （3）秒表 （4）试管 16支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取16支大试管， 1 支作空白， 3支留作未知样品，其余试管分成两组， 分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/m1）。用水 补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20 25）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。这一步 混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的 第一支试管作为空白对照，于
7、700nm 处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座 标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支 试管加入5 毫升试剂甲后，开始计时， 1 分钟后，第2支试管加入5 毫升试剂甲， 2分钟后 加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即 加入0.5毫升试剂乙， 1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙， 2分钟后加第3支试管，余 此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一 个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预
8、先画好下面的表格。 表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面 两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。2. 样品的测定：取1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操作， 取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起， 同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。 根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白 质浓度。注意，由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而 变化。因而
9、本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。http:/ 4&lanmu=12实验三福林一酚法测定蛋白质含量一基本原理福林-酚试剂（Folinphenol reagent）的显色原理是：首先在碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白 质-铜复合物，该复合物随之将磷钼酸-磷钨酸还原成蓝色复合物。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质含量 成正比，测量范围约在25250 ug/ml蛋白质浓度。虽然该法是测定蛋白质浓度应用最广泛的方法之一， 但其缺点也很明显，专一性较差，干扰物质多(如Tris缓冲剂，蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类、柠檬酸 等)，标准曲线的直线关系不特别严格。因此在其应用过程中有很多
10、新的修正。(一)LOWRY基本法1试剂(1) 试剂甲：(A) lOgNaCO, 2gNaOH和0.5g酒石酸钾钠(或钠盐或钾盐)溶于500ml蒸馏水。(B)23O.5gCuSO 5HO溶于100ml蒸馏水。每次使用前将两溶液以A： B = 50 ：1混合，此为试剂甲。42(2) 试剂乙：在1.5升的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(NaWO2H O), 25g钼酸钠(NaMoO2H O)2 4 2 2 4 2 及700ml蒸馏水，再加50ml85%磷酸，100ml浓盐酸，充分混合，接上回流冷凝管以小火回流10小时。回 流结束后加入150g硫酸锂，50ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15min
11、以便驱除过量的溴，冷却后 溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤)。将溶液稀释至1升，过滤，滤液置棕色瓶中保存 使用时用标准氢氧化钠滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释(约加1倍水)，使最终的酸浓度为1mol/ L。(3) 标准蛋白质溶液：取结晶BSA溶于蒸馏水，浓度为250 ug/m1o(4) 未知蛋白质溶液： 取动物血清，使用前稀释100倍，2操作步骤取试管编号按下列顺序加入各试剂123456789蛋白质含量(口g)02550100150200250一一一一250 ug/ml BSA(m1)00.10.20.40.60.81.0一一一一待测蛋白(m1)一一一一一一一一一一一一一一0
12、.51.0HO(m1)21.00.90.80.60.40.2一一0.5一一试剂甲均加入5ml摇匀，室温下放置10min试剂乙(1mol/L)均加入0.5m1，立即混匀，室温放置30min后比色A650计算：以光吸收值(A )对蛋白质含量作图，求其蛋白质含量。650在原始文献中的试剂甲配方如下：20g Na CO溶于0.1mo1 / LNaOH 1000ml中；0.5g硫酸铜溶于1%酒23石酸钾钠中，使用前将按：= 50： 1(V/V)混和。酒石酸盐可用1%柠檬酸三钠代替，更易于保存。比 色测定时的波长可选650nm或660nm，若蛋白质浓度在20T00ug.可选用750nm(在660nm所读取
13、的光吸收为750nm的90%)，若在125ug以上可采用500nmhttp:/ 17:07:57福林-酚试剂法是生化中广泛使用的蛋白质定量方法，在国家药品标准中也普遍采用此法测定不同的蛋白质的含量。现将标准中执行的几点总结如下：1、酚试剂A及酚试剂B的浓度和用量不同：具体见下表。Folin-酚试剂AFolin-酚试剂B牛血清白蛋白标准曲线 浓度（gg/ml）反应过程及测定 波长方法一氢氧化钠10g，碳酸钠50g,加水400ml 使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g, 加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g, 加水30ml使溶解，两液混合，作为乙 液，合并上述甲、乙液，加水至500ml。 取
14、1.0ml4.0ml (贮备液116)30、 90、 150、 210 和 27055 C准确反应5 分钟，冷却，在650nm测定方法24%无水碳酸钠溶液25ml，0.2mol/L氢 氧化钠溶液25ml，2%酒石酸钾钠溶液 0.5ml， 1 %硫酸铜溶液0.5ml，上述四 液合并，取4.0ml0.5ml(1mol/L)20、 40、 60、 80 和 10037 C水浴保温30 分钟，冷却，在 750nm测定标准中最常见上述两种方法（其他的略有不同），有的标准中B的配制浓度会有错误, 应仔细核对，一般加入量折算为0.5mmol为宜。2、不同样品中含有的辅料（或赋形剂）的影响：大多数多肽样品的制剂均添加赋形剂，例如冻干制剂一般添加甘露醇作为赋形剂。甘露 醇在福林-酚试剂中亦显色，严重的会干扰样品的测定，据笔者多次试验结果观察，同一浓 度不同试剂级别的甘露醇显色后的吸光度也会不同。3、在具体操作中的几个细节
