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1、IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法点击次数： 201 发表于：2008-08-23 16:56转载请注明来自丁香园 来源：丁香园以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。纯化IgG小量几十ml的话，用prote
2、in A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。之前根据载量估计一下需要的柱子体积。实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加
3、热蒸发H2S即可。3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO42H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO412H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。8、透析袋（或
4、玻璃纸）二、操作方法1、取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成20%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。2、3000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。3、在上清液中再加（NH4）2SO4饱和溶液30ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置30min。4、3000r/min离心20min，弃上清。5、于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加（NH4）2SO4饱和溶液10ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合后，静置30min。6、3000r/min离心20min，弃上清，以除去
5、白蛋白。重复步骤5，23次。7、用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。8、透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4透析24h，中间换液数次。以1%BaCl2检查透析液中的SO42-或以纳氏试剂检查NH4 （取34ml透析液，加试剂12滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无SO42-或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。9、离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即球蛋白，如以36%的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含球蛋白）。10、过DEAE纤维素层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaC
6、l）洗脱，收集洗脱液。也可采用SephadexG150或G200柱。11、蛋白质及其定量鉴定。12、IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。（1）区带电泳玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。（2）琼脂双相双扩散鉴定预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。（3）免疫电泳鉴定孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形
7、的沉淀线，且沉淀线位于球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。（4）圆盘电泳鉴定用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。13、IgG的浓缩与保存（1）IgG的浓缩（2）IgG的保存一般浓缩至1%以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。四、蛋白质的分离纯化从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的，需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是有其它物质伴随混入提取液中。但有些
8、杂质（如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后操作。常用有机溶剂提取除去。对于异类物质，提纯蛋白质和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶水解，有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等方法处理。小分子物质常在整个制备过程中通过多次液相与固相转化中被分离或最后用透析法除去。而对同类物质如酶与杂蛋白、RNA、DNA 以及不同结构的蛋白质、酶、核酸之间产分离，情况则复杂得多。主要采用的方法有盐析法、有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法、吸附法、结晶法、电泳法、超离心法及柱层析法等。其中盐析法、等电点法及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多，有机溶剂抽提和沉淀用于核提纯较多，柱层析法、梯度离心法对蛋白质和核酸的提纯应用十分广泛
9、。如前所述，蛋白质的分离纯化较难，而且其本身的性质又限制了某些方法的使用，因此要研究目的物的微细特征，巧妙的联用各种方法并进行严密的操作，同时有必要了解精制各过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白质可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加为尺度进行追踪。其他蛋白质可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度。如结晶核糖核酸酶经层析分为两个成分。可见对确定蛋白质结晶纯度尚无最终的尺度。根据经验即或纯净的标准品，有极微量的不纯物时，也会给实验带来较大的影响。不稳定的蛋白质，如分离SH-酶时使用试剂及缓冲液等，要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低
10、分子化合物不同，必须经过独特的繁琐操作。蛋白质和蛋白质相互分离主要利用它们之间的各种性质的微小差别。诸如分子形状、分子量大小、电离性质、溶解度、生物功能专一性等。蛋白质提取液中，除包含所需要的蛋白质（或酶）外，还含有其它蛋白质、多糖、脂类、核酸及肽类等杂质。除去的方法有：1）核酸沉淀法该法可用核酸沉淀剂和氯化锰、硫酸鱼精蛋白或链霉素等。必要时也可用脱氧核糖核酸酶除去核酸。即在粗匀浆中加入少量DNase,于4保温3060min，可使DNA 降解为足够小的碎片，以致不影响以后的纯化。2）醋酸铅沉淀法利用醋酸铅沉淀剂除去杂蛋白。因这些沉淀剂也常常使需要的酶（或蛋白质）缓缓变性而失去活性，所以用这类试
11、剂时应迅速进行盐析，使样品与这类试剂脱离接触。3）调pH 值或加热沉淀法利用蛋白质酸碱变性性质的差异除去杂蛋白。利用蛋白质的热变性的温度系数差异，可在一定的PH 下将蛋白提取液加热到一定的温度，使对热不稳定的杂蛋白性沉淀而除去。4）选择性变性法利用各种蛋白质稳定性的不同，可用选择性变性法来除去杂蛋白。例如胰蛋白酶及细胞色素C 等少数特别稳定的酶，甚至可用2.5%三氯醋酸处理，此时其它杂蛋白均变性而沉淀，而胰蛋白酶和细胞色素C 则仍留在溶液中。5）透析法小分子物质常在整个制备过程中多次液相与固相互转化中被分离，或最后用透析法除去。 1、利用溶解度不同的纯化方法原理：盐析法对于许多非电解质的分离纯
12、化均适合。对蛋白质和酶的提纯应用也最早。至今还广泛使用，一般粗抽提物经常利用盐析法进行粗分。也有反复用盐析法得到纯的蛋白质的例子。其原理是蛋白质在低盐浓度下的溶解度随盐液浓度升高而增加（盐溶，与离子强度101 间成比例增加）。球蛋白当盐浓度不断上升时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出（盐析）（离子强度I210）。这是由于蛋白质分子内和分子间的电荷的极性基团有静电引力。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分子一的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出。盐析法是根据不同蛋白
13、质在一定浓度盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法。盐析时蛋白质的溶解度与溶液中离子强度的关系，可用下式表示：S1g-=-kslSo式中S0 为蛋白质在纯水（离子强度I=0）中的溶解度，S 为蛋白质在溶液的离子强度为I 时的溶解度，KS 为盐析常数。离子强度可用下式计算。： 1I=-miZi22式中mi 为溶液中各种离子摩尔浓度，Zi 为各种离子的价数。式中当温度一定时，S0 对于某一蛋白质在某溶液中的溶解度是一常数，故（1）式也改定为：lgS=-ksI式中=lgS0，也为一常数，值主要取决于蛋白质性质，其次与溶液的PH 和温度有关。ks 值主要和盐的性质（包括盐离子价数和平均半径）有关
14、，也与蛋白质结构有关。一般来说，蛋白质在某一盐液中ks 愈大，盐析效果愈好。蛋白质是具有许多亲水基团的偶极离子，常需用要较高的I 值才能从溶液中析出。根据（3）式分离纯化蛋白质，可在一定的PH 和温度下改变盐的I 值，称为“ks 分段盐析法”，提纯前期常应用此法；也可在一定I 值下改变PH 及温度，称为“分段盐析法”，常用于提纯后期，特别是使某些蛋白质结晶析出时。盐的选择：如上所述，蛋白质在水中溶解度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白质的溶解度。控制方法最常用的是加入中性盐。主要有硫酸铵、硫酸镁 、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
15、其中应用最广的是硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25时饱满和溶解度为4.1mol,即767g/l;0时饱满和溶解度为3.9mol,即676g/l）。在这一溶解度范围内，许多蛋白质均可盐析出来，且硫酸铵价廉易得，分段效果较其它盐好，不易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时对蛋白氮的测定有干扰，另外缓冲能力较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30以下溶解度太低。其它的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。氯化钠的溶解度不如硫酸铵，但在不同温度下它的溶解度变化不大，这是方便之处。它也是便宜不易纯化的试剂。硫酸铵浓溶液的PH 常在4.55.5 之间,市售的硫酸铵还常含有少量游离硫酸,PH 值往往降至4.5 以下,当用其他PH 值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节.硫酸铵饱和度计算及加入方式在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3 种。一种是当蛋白质溶液体积不大所需调整的浓度不高时，加入饱和硫酸铵溶液。配制法是加入过量的硫酸铵，热至5060保温数分钟，趁热滤去沉淀，再生0或25下平衡12 天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算：S2 -
