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1、阐明(本页勿需打印）：1） 封面：本试题页打印出来作为试卷封面(A4纸）。2） 请用蓝色签字笔或钢笔书写，笔迹公正,行距恰当。3） 每道题的答案前写上番号即可。4） 请按学位类别完毕试卷。5） 请负责同窗按学号整顿试卷后准时交卷。6） 联系电话： 张雪梅教师 周兰教师7） 交卷时间:2-21 重庆医科大学级学术型研究生研究生蛋白质组学试题 学位：医学 姓名 学号 所在院系 123456789平时成绩总分1、 列举蛋白质组学研究中常用的样品制备技术。简述双向电泳技术的原理及其特点(0分）。答：（1)激光捕获显微切割技术(LM）、高丰度蛋白清除技术、自由流电泳技术（F)（2)原理:根据蛋白质的等电
2、点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一种方向上按照等电点高下进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离。二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一种蛋白质。特点:双向电泳辨别率最高：信息量最大;pH梯度稳定；反复性好。2、 如何保证亚细胞蛋白质组学研究中的样品纯度(10分）？答：细胞内不同构造的比重和大小都不相似，在同一离心场内的沉降速度也不相似,根据这一原理，常用不同转速的离心法,将细胞内多种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的措施是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程涉及组织
3、细胞匀浆、分级分离和分析三步。匀浆，低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等渗匀浆介质（即mlL蔗糖-0.003molL氯化钙)进行破碎细胞，使之成为多种细胞器及其涉及物的匀浆。分级分离，由低速到高速离心逐渐沉降。由于样品中多种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，因此每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化措施进行形态和功能鉴定。一般从三个方面对亚细胞器的纯度进行评价：1电子显微镜检测2.标志酶活性测定3.Westbot。3、 举例阐明药物蛋白质组学在新药研究领域中的应用(10分)。答：药物蛋白质组
4、学重要应用于:(1)临床前研究发现所有也许的药物作用靶点,以及针对 这些靶点的所有也许的化合物,以及应用蛋白质组学措施研究药物作用机制和毒理学;(2)临床研究方面发现药物作用的特异蛋白作为患者选择有效药物的根据和临床诊断的标志物，或以蛋白质谱的差别将患者分类并予以个体化治疗。举例：药物蛋白质组学在药物靶点发现和确认中的应用（1） 研究人员通过比较给药前后的蛋白质组，找到了药物阿霉素抗乳腺癌的一种作用靶标Hsp7。(2)疟原虫入侵血红细胞的阻断靶点探测:半胱氨酸蛋白水解酶是疟原虫生存必需的酶,Greeaum等运用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化学探针I125DCG-04打靶,然后通过抗DCG04的生物
5、素纯化,得到了半胱氨酸蛋白水解酶类的亚蛋白质组;通过酶活性分析,最后发目前疟原虫的入侵血红细胞的裂殖期,仅有一种有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白质acain1;从数据库筛选到falcipin1的克制剂YA2-Es,成果证明A29-ps可阻断疟原虫的入侵红细胞。4、试述免疫共沉淀的原理及其优缺陷，并举例阐明重要用途(10分）。答:免疫共沉淀原理：是以抗体-抗原之间的专一性作用为基本的用于研究蛋白质互相作用的典型措施,是拟定两种蛋白质在完整细胞内生理性互相作用的有效措施。基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的互相作用被保存下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀,那
6、么与x在体内结合的蛋白质也能被沉淀下来。该技术可用于鉴定两种目的蛋白质与否在体内结合以及进行结合位点分析,还可用来筛选一种特定蛋白质的新的作用伙伴。长处：互相作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处在天然状态;蛋白的互相作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响。缺陷：1.需要高质量的抗体进行I;2.两种蛋白质的结合也许不是直接结合，而也许有第三者在中间起桥梁作用;3.检测不到弱或瞬时的互相作用。技术用途：.鉴定两种目的蛋白质与否在体内结合,以及进行结合位点分析；.筛选一种特定蛋白质的新的作用伙伴。5、 请比较蛋白印迹技术和免疫组化的异同（10）。答：免疫组化又称免疫细胞化学，运用抗原抗体特异性反
7、映对组织细胞中的特写抗原（或抗体）进行定位和定性的一种染色技术。为了显示和观测细胞内抗原抗体反映，需要预先将某种示踪性物质结合到特定的抗体上,借标记示踪物的荧光或酶的有色反映、放射性或高电子密度，在光镜或电镜下进行定性、定量或定位观测。根据显示物质的不同，分为免疫荧光技术、免疫酶技术、亲和组织化学技术和免疫金银技术等，以免疫酶技术最为常用。免疫印迹又称为Wsten blot,是先借助凝胶电泳将蛋白质抗原分离,然后将凝胶中的蛋白质转印至膜上,使之成为被分离蛋白的一种拷贝。抗原的位置就可用特异性抗体拟定。免疫印迹可以用来检测样品中与否存在蛋白抗原，以及该抗原的含量或该抗原多肽链的相对分子质量等。它
8、还可用于拟定蛋白质的酪氨酸残基与否发生了磷酸化。免疫印迹高效、简便、敏捷。免疫组化呈现的是天然状态的抗原，而免疫印迹使抗原完全变性,并且部分纯化，但需要与固相支持物结合。这也使两者需要不同特性的抗体。免疫组化用于抗原的定位与半定量，但如果需要对抗原体现进行精拟定量，还是需要做免疫印迹,更具说服力。6、 质谱仪的构成要件和以MALITO MS获得PMF的分析流程(0分）。答：(）质谱仪一般由进样装置、离子化原、质量分析器、离子检测器、数据分析系统构成。(）ALD-TO-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，并且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，因此MAD-TOF成为进行分析PM的首选措施。1
9、.将待测样品与基质混合并置于样品板上干燥。2.将样品板放入质谱仪的样品。样品点被激光脉冲照射,解吸，离子化。4离子被电场加速，进入真空漂移管5.离子的/z不同，飞行时间不同,先后达到检测器。将分离得到的成果,与数据库对比,得到肽质量指纹谱后，再在数据库中查询鉴定蛋白质。7、 谈谈血浆蛋白质组学研究中需要着重注意的问题以及目前多维方略的研究进展（分）。答：1、血浆/血清样品选择去血小板的血浆由于避免血小板的激活作用,减少了蛋白质的体外降解,因而较血清更适合一定的肽组学研究；去血小板的DA血浆或枸橼酸血浆样品，更适合分析低分子质量的蛋白质；如果要使用一定的蛋白酶克制剂，一定要在初期加入，并且要谨慎
10、使用,由于克制剂的加入也许对分析导致一定的干扰,并且某些小分子的克制剂与蛋白质结合转化成蛋白质的亚型，这些都将使得分析成果变得复杂。2、样品的收集与贮存为减少血小板的污染，血液样品在分析前最佳用2m的低蛋白质结合膜过滤,样品分装冰冻储存,减少融化-再冰冻的循环;样品应分装并贮存在液氮中,减少或不加蛋白酶克制剂，以减少对测定成果的干扰。3、清除高丰度蛋白和分级技术血浆血清样品中蛋白质种类诸多,并且所含蛋白质具有较大的动力学范畴,其中有许多丰度较高但不具有特殊生物学信息的蛋白质，这将会对目的蛋白质的分析导致极大的困难，甚至主线不能检测低丰度蛋白质,因此，通过对原始蛋白质进行洗脱和分步分离减少样品中
11、蛋白质的复杂性，可以极大简化蛋白质的预测和分析，提高对低丰度蛋白质的检测和辨认的敏捷度和精确度。4、多维方略的运用：联合使用不同技术平台并加以合适改善是目前最通用的手段：重要涉及：清除高丰度蛋白、样本预分离系统、分离系统、质谱鉴定系统8、 试述临床肿瘤蛋白质组学研究的标本及其特点（1分)。答:）组织细胞标本如手术切除和穿刺活检组织：组织细胞新鲜，组织形态保存好,可协助临床对病变作出诊断或为疾病诊断提供线索。理解病变性质、发展趋势,判断疾病的预后。验证及观测药物疗效，为临床用药提供参照根据。发现新的疾病或新的类型，为临床科研提供病理组织学根据。2） 福尔马林固定-石蜡包埋组织：组织形态保存好,穿
12、透性强,组织收缩少,且能作持续切片,有助于多种染色对照观测;石蜡块还能长期存档，供回忆研究。3)多种体液:（1)乳头溢液、痰液、泪液等 （2)尿液(3)多种消化液（胰液、胃液、唾液等）（4)脑脊液、关节腔液(）血液*液体活检(6）肿瘤间质液:对外周血中游离DNA和循环肿瘤细胞及其中的核酸和蛋白质等进行全面分析,以避免侵入性的活检；取样患者肿瘤的所有片段,可以评估肿瘤的异质性。反映出肿瘤的大体轮廓,涉及当时患者肿瘤的所有突变 、甚至癌细胞扩散的方式和途径。9、 结合自己专业，简述应用蛋白质组学措施寻找疾病标志物的程序（环节)及相应技术（10分）。 答:环节：、鼻咽癌细胞系组织的（全）蛋白质体现谱
13、构建:肿瘤蛋白质组体现谱及其蛋白质组数据库是进一步开展肿瘤蛋白质组有关研究的基本。LCM纯化，2DE、分离鉴定差别体现蛋白,WesterBl验证，免疫组化验证。2、 鼻咽癌与正常鼻咽上皮的比较蛋白质组学筛选标志物，肿瘤细胞与其来源的正常细胞的比较蛋白质组学研究是发现肿瘤标志物和治疗靶标的最直接和合理的方式之一。为提高肿瘤标志物筛选的精确性，有必要从组织中纯化靶细胞用于蛋白质组学研究。3、 血清蛋白质组学研究样本收集;分离和鉴定；体现验证;功能验证。技术： 典型的-DE在一定范畴内得到应用，能直接比较蛋白质水平的差别。直接质谱法之色谱-质谱联用：蛋白酶解为多肽，再鉴定和定量这些多肽，即可获得原始
14、蛋白的质和量的信息；涉及标记法和非标记法;该操作相对简朴;但由于原始蛋白的某些信息会在酶解时丢失(如蛋白降解),其成果是不全面的 直接MADI(基质辅助激光解吸电离）SELDI(表面增强激光解吸电离），即不酶解,直接进行质谱分析;更合用于高通量研究，但是后续的蛋白质/多肽鉴定往往成为此类实验的瓶颈 其他措施：涉及基于抗体的措施,如自身抗体、抗体芯片等。如：血清蛋白组学分析:即分别用病人和正常人的血清作为一抗，筛选肿瘤组织中的差别蛋白质，即肿瘤抗原。其实质是 DE + 免疫印迹技术流程:肿瘤组织或细胞总蛋白2DE分离转膜膜与病人血清及对照血清反映质谱鉴定差别反映点的蛋白拟定肿瘤抗原。病人血清及对
15、照血清：差别的就是前者有针对肿瘤抗原的抗体 （1)通过蛋白组学技术已经发现的T（举例）(）组学技术可提高诊断的敏感性和特异性(3)肿瘤标志物联合检测的必要性。如童急性淋巴细胞性白血病蛋白标志物的发现和鉴定。先应用SLI-TFMS技术，比较小朋友ALL患者血清和健康小朋友血清的蛋白质体现谱，寻找患者与健康小朋友血清中的差别蛋白，拟定潜在的蛋白质生物标志物,然后运用HLC分离纯化差别蛋白，最后运用MADITOF-MS 及LC-MS/MS鉴定差别蛋白。1、 比较小朋友ALL患者血清和健康小朋友血清的蛋白质体现谱环节：样本收集、溶液制备、LDIOFM分析、数据分析，寻找患者与健康小朋友血清中的差别蛋白。2、 潜在蛋白质生物标志物的分离纯化：血清样品的预解决、潜在生物标志物蛋白的HPLC分离纯化、HPLC分离所得蛋白组分的ALDITOF-MS检测。3、 目的蛋
