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1、糖含量测定实验方案1. 还原糖浓度测定简介还原糖是指含有自由醛基和酮基、具有还原性的糖类。黄色的 3，5-二硝基 水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3- 氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成 正比，在波长为 540nm 处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得 样品中还原糖的含量。不具还原性的部分双糖或多糖经酸水解后可彻底分解为具有还原性的单糖。 通过对样品中的总糖进行酸水解，测定水解后还原糖含量，可计算出样品的含量。 由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含 量时应乘以系数 0.9。实
2、验设备及试剂设备： 分光光度计、电热恒温水浴锅、试管及试管架、容量瓶、移液器、量筒。试剂： 1 mg/ml葡萄糖标准液准确称取80C烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸 馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4C冰箱 中保存备用。 DNS试剂（3, 5-二硝基水杨酸）称取3，5 二硝基水杨酸（10 土 0.1） g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧 化钠10 g,在50 C水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚 （重蒸）2 g和无水亚硫酸钠5 g,待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至 1000 mL，过滤。贮存
3、于棕色试剂瓶中，于暗处放置7 d后使用。操作方法（ 1 ）葡萄糖标准曲线制作取9支干净试管编号，按表1加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和 DNS 试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。表 1 葡萄糖标准曲线制作试剂012345678葡萄糖标准溶液（ml）00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水（ml）21.81.61.41.21.00.80.60.4DNS(ml)1.51.51.51.51.51.51.51.51.5葡萄糖含量（mg）00.20.40.60.81.01.21.41.6叫40将以上溶液，封口置沸水浴煮5min,冷浴冷却，定容至25mL，以0号管为对照，在
4、540nm 下测定吸光值，以葡萄糖质量为纵坐标，吸光度为横坐标，拟 合曲线。（2）样品中还原糖测定样品中还原糖的提取：准确称取1.00g样品，放入100ml烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后 补足至50ml蒸馏水，搅匀，煮沸5min,是还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转 移到50mL离心管中，于4000r/min离心5min，沉淀可用20ml蒸馏水洗一次， 再离心，将两次离心的上清液收集在 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混 匀，即为稀释 100 倍的还原糖待测液（实际操作时可根据需要稀释至适当倍数： 10、20、30、40、50、100、200 等）。表 2 样品还原糖测定试剂01
5、23样品溶液（ml）01.01.01.0蒸馏水（ml）2.01.01.01.0DNS(ml)1.51.51.51.5OD540通过标准曲线计算 得到的还原糖量（mg）样品中还原糖质量分数（）还原糖的测定：取4 支试管，编号0、1、2、3.以制作标准曲线相同的方法，在 1-3号试管分别加入1ml待测液和1ml蒸馏水，1.5ml DNS（保证与葡萄糖标准曲线制作相同 的反应体系），而对照的0号管内则加2ml的蒸馏水和1.5ml DNS.封口置沸水浴 煮5min，冷浴冷却，定容至25ml.在540nm下测吸光度。结果计算计算光密度的平均值，根据所得标准曲线即可得到还原糖的质量C，按下列计算样品还原糖
6、和总糖的含量。O - C x V x100m计算公式由公式：还原糖x100查曲线所得葡萄糖毫克数x提取液总体积/测定时所取用体积样品毫克数整理所得。式中， 还原糖（以葡萄糖计）的质量分数，%；C还原糖或总糖提取液浓度，mg/ml，本公式中C即为根据标准曲线计 算得到的还原糖毫克数（测定时取用体积为 1ml）；V提取液的总体积，ml （提取液的总体积即为稀释倍数）；M样品质量，mg。实验注意事项 样品的稀释倍数要保证计算得到的葡萄糖浓度在标准曲线线性关系良好范 围内。以往经验和文献报道表明，OD540在0.1-0.4范围内数据较为真实。2. 总糖浓度测定简介糖类在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生
7、成糠醛或羟甲基糖醛后，与蒽酮（C14H10O）脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色。该物质在620 nm处有最 大吸收，在150 pg/ml范围内，其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。这一方法 有很高的灵敏度，糖含量在30pg左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。 一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。实验设备及试剂仪器： 电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等 试剂：（1）葡萄糖标准液：100 pg/ml（ 2 ）浓硫酸 、浓盐酸（3）蒽酮试剂： 0.2 g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中。当日配制使用。 操作方式1 ）葡萄糖标准曲线的制作：取7 支试管，
8、按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液管号1234567葡萄糖标准液（ml）00.10.20.30.40.50.6蒸馏水（ml）10.90.80.70.60.40.2葡萄糖含量（ug0102030406080在每支试管中立即加入蔥酮试剂4.0m1,迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完 后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10 min 取出，用冰浴冷却至室温，在 620 nm 波长下以第一管为空白，迅速测其余各管 吸光值。以标准葡萄糖含量（pg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。（2）总糖的提取：精确称取0.5g，置于50 ml三角瓶中，加水15 ml，浓盐酸10ml，沸水浴 20min，定容至100ml，得提取液。取10ml滤液定容至100ml。（ 3）测定吸取 1 ml 已稀释的提取液于试管中，加入 4.O ml 蔥酮试剂，平行三份；空 白管以等量蒸馏水取代提取液。以下操作同标准曲线制作。根据A620平均值在 标准曲线上查出葡萄糖的含量（pg）。结果计算C X V V D样品含糖量（%）C 总 X100W X V X106测其中：C在标准曲线上查出的糖含量（pg）,V 总提取液总体积（ ml），V 测测定时取用体积（ ml），D稀释倍数，W样品重量（g）,106样品重量单位由g换算成pg的倍数。
