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1、Dept. of Biochemistry & Molecular Biology, NJMU. RIPA裂解液终浓度母液10ml裂解液用量Tris-HCl PH7.550mM0.5M1mlNaCl150mM0.75M2ml脱氧胆酸钠1%100%固体0.1gSDS0.25%10%250ulNP-401%100%100ulTriton X-1001%100%100ul去离子水6.55ml分装存于-201年。用前加100g/ml PMSF（神经毒，注意防护）和 1% cocktail30%Acr-Bis贮液Acrylamide29gBisacrylamide1g去离子水定容至100ml，（过滤），
2、用锡纸避光，4保存6月；神经毒，注意防护分离胶缓冲液1.5 M Tris-HCl PH8.8（4保存1年）Tris-base18.15g去离子水80ml调PH值至8.8，定容至100ml浓缩胶缓冲液1M Tris-HCl PH6.8（4保存1年）Tris-base12.1g去离子水80mlHCl调PH至6.8，定容至100ml10%SDS（室温保存1年）SDS5g去离子水定容至50ml10%AP（41周）AP0.1g去离子水1ml电泳缓冲液（4保存6月）；注意甲醇毒性甘氨酸2.9gTris-base5.8gSDS（分子量6月）Tris-base24.2gNacl80gTween-2010ml去
3、离子水800mlHCl13.8mlHCl调节PH至7.6 定容至1L考染液终浓度实用500ml加甲醇50%100%原液250ml乙酸（冰醋酸）10%100%原液100ml水定容至500ml考马斯亮蓝R2500.25%固体1.25g注可反复利用n次；室温至少4h或过夜；若加快染色可37 1h（5060，30min）注意甲醇毒性0.5ug/ul BSA 10mlBSA50mg水100ml在1cm的比色杯测A280=3.3（1ug/ul BSA为6.6）以鉴定，分装1ml冻于-201年考马斯亮蓝溶液（bradford液）500ml考马斯亮蓝G25050mg95%乙醇25ml磷酸50ml去离子水定容至
4、500mlWhatman 1 号滤纸过滤，于4保存1年。用前取2ml用去离子水稀释至10倍体积，工作液可反复利用而不影响后续。2loading buffer终浓度实用5ml加SDS4%固体200mg水3.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）Tris-HCl, PH 6.8120mM1M0.6mlDTT0.2M固体155.4mg甘油20%100%原液1ml注500ul 分装-20保存1年，融化后4保存2周2月5loading buffer终浓度实用2ml加Tris-HCl, PH 6.8300mM1M0.6mlSDS10%固体200m
5、g水0.85ml (PH 6.8 Tris-HCl加后利于溶解SDS，SDS+ DTT增加150ul体积）Tris-HCl, PH 6.8150mM1M0.6mlDTT0.5M固体155.4mg甘油50%100%原液1ml注500ul 分装-20保存1年，融化后4保存2周2月stripping buffer 50ml（个人修改的dxy配方）stripping buffer（抗体技术实验指南配方）Tris-HCl (1M,pH6.8)3125mlTris-HCl pH7.050mMSDS1gSDS2%-mercaptoethanol350ulDTT50mMddH2O定容至50ml。50-55,
6、摇30min清洗数次。洗脱后PBS或TBS清洗数次70, 30min。洗脱后用中性液如PBS清洗数次替代方案（dxy配方）：0.5M NaCl，0.5M HAc；室温摇床15min。洗脱后PBS或TBS清洗数次。组织蛋白提取（对所有组织尤其组织量少或韧性较高组织可采用液氮研磨方法，效果亦佳）1加裂解液，按照1：5（重量/体积），0.1g组织加500ul裂解液2冰上匀浆6000r/min5s5次3超声150300w 6s，间隔15s，共36次4静置10min5415000r/min离心15min6取上清，测蛋白含量，余蛋白（上样缓冲液变性后）分装冻存于-20Bradford法测蛋白浓度管号012
7、345样本Bradford液1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml0.5g/lBSA05l10l15l20l25l1l0.9%NaCl100l95l90l85l80l75l99lOD值595nm测OD值做标准曲线，求得方程y（浓度）=ax（OD）+b；代入样本OD（样本OD减去1ul裂解液OD）即为浓度（g/l）*样品浓度最好为10g/lWestern blot（蛋白免疫印迹）I SDS-PAGE电泳1清洗玻璃板，陶瓷片，组装2配分离胶，37静置25min。开变性炉预热3配浓缩胶，室温静置20min4蛋白70100变性5min5冰上冷却后加样，电泳（浓缩胶80100V，分离胶160200V
8、）II 半干式转膜1电泳结束后，戴手套，切膜、滤纸和胶（切角标记）2转膜缓冲液中泡10min3从下至上：6层滤纸，膜，凝胶，6层滤纸，赶除气泡，尤其注意膜和凝胶之间禁留气泡。擦干多余液体， 0.8mA膜面积（cm2）电流转膜1.52hIII 免疫印迹1转膜结束，检验marker是否已转至膜上。5%脱脂奶粉4封闭过夜2加一抗，室温摇动2h3TBST漂洗3次，每次10min4加二抗，室温摇动1h5TBST漂洗3次，每次10minIV ECL检测1AB液混合，待膜干后，平铺其上2待反应35min后，根据荧光强度暗室压片5s30min3显影1530s，水洗，定影0.51min4图片扫描和定量12%（10%）分离胶（10ml）水3.3ml（4ml）30%Acr-Bis4ml（3.3ml）分离胶缓冲液2.5ml10%SDS100ul10%AP100ulTEMED8ul5%浓缩胶(5ml)水3.4ml30%Acr-Bis0.83ml浓缩胶缓冲液0.63ml10%SDS50ul10%AP50ulTEMED10ul2
