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1、活血化瘀方药对Poresky 大鼠模型内皮细胞的影响【摘要】 ：目的观察活血化瘀方药对Poresky多囊卵巢综合征大鼠模型内皮细胞功能及形态的影响。方法依照Poretsky法建立PCOS大鼠模型，随机分为中药组、模型组，并设立正常组作对照。测定各组血清FSH、LH、T、INS及血浆ET、PAI1的水平，电镜观察内皮细胞形态及超微结构变化。结果模型组内皮细胞间的连接失去正常形态，基底膜不连续，细胞膜损伤、不完整；胞质内空泡明显增多，线粒体膨胀，嵴溶解、断裂、消失；细胞核聚集，异染色质增多。中药组主动脉内皮细胞间连接较紧密，线粒体无明显肿胀，嵴清晰，吞饮泡和溶酶体增多，胞质偶见空泡。模型组血浆PA
2、I1、ET比正常组增高，差异有显着性，中药组与模型组比较，ET、PAI1降低；与正常组比较PAI1水平无显着差异，ET增高。结论PCOS大鼠模型存在内皮细胞形态、超微结构改变，血浆ET、PAI1升高，提示PCOS存在血瘀的微观病理基础。活血化瘀中药能够从形态学上修复PCOS大鼠损伤的内皮细胞，调整内皮细胞功能。【关键词】 多囊卵巢综合征；动物模型；活血化瘀；内皮细胞Abstract： ObjectiveTo observe the effect of Chinese herbs for activating blood stasis on the shape and function of t
3、he endothelial cells in rat aorta.MethodRat models of PCOS have been established according to Poresky, randomized into animal model and Chinese medicine group(TCM group)，normal rats were control group. Measure the serum level of FSH, LH, T, INS and plasma ET PAI1, and observe the endothelial cell mo
4、rph.Results In the model group,the endothelia cells of the aorta were contracted, with discontinuous basement membrane, inflated chondriosome, the middle layer smooth muscles tending to move inside and out of the normal shape of intraendothelial junction. In the TCM group, the endothelial cells appe
5、ared flat, arranging along the long axis of the blood vessels, normal endothelial cell integrity with scanty cytoplasm and the microscopic appearance shows highly developed golgiosome rough endoplasmic reticulum and smooth endoplasmicmodel group had a more increased serum level of PAII and ET than t
6、hose of the control group, and showed the significant difference (，). The TCM group had a significantly lower serum level of PAII and ET than those of the model group(). There were no significant differences between the normal group and the TCM group on serum level of PAII (). The TCM group had more
7、 decreased level of ET than those of the normal group(). Conclusion The morphologic changes of the endothelial cells and increase of ET and PAII were found in the PCOS model rat，indicating blood stasis was one pathogenesis ofherbs for activating blood stasis could morphologically repair damaged endo
8、thelial cells, regulate their functions.Key words: PCOS；animal model；activating blood stasis；endothelial cell 根据临床实践多囊卵巢综合征患者即使无血瘀证的外在征象，临床上在辨证施治的同时，适当佐以活血化瘀之法，有助于提高疗效，从而提高排卵率。根据“以方测证”的原则，推测PCOS存在血瘀的微观病理改变。因此，本研究建立PCOS大鼠模型，观察内皮细胞功能和形态变化及活血化瘀中药对其影响，寻求活血化瘀中药治疗多囊卵巢综合征的微观证据。1 材料与方法材料SD雌性大鼠30只，SPF级，体重g，由
9、广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)20030001粤监证字2005A031。胰岛素注射液(沈阳济世制药有限公司)、注射用人绒毛膜促性腺激素(HCG)(丽珠集团丽珠制药厂)、FSH、LH、E2、T检测试剂盒、PAI1检测试剂盒、胰岛素检测试剂盒、内皮素检测试剂盒。活血化瘀方药，煎沸浓缩，制成/ml，4保存备用。中药饮片由广州中医药大学第一附属医院中药房提供。方法动物分组及处理30只大鼠随机分为正常组对照、模型组、中药组，每组10只。每周称录体重1次，每天进行阴道涂片检查。2周后，模型组依照Poretsky法1每只动物皮下注射，2次/d，共9d；胰岛素注射液于第111d内自/
10、d开始，逐渐递增至/ d，并按此剂量维持至22d，以5葡萄糖溶液替代日常饮水中药组给予中药按25g/kg灌胃，每天9：00灌1次，连续21d。正常对照组每天注射等容积生理盐水并灌胃给予等体积常水。末次给药后禁食过夜，翌日动物称重，乙醚麻醉后取眼眶静脉血后，分离血清，置-20冰箱保存，待放射免疫测定FSH、LH、E2、T、ET、INS，酶免测定PAI1。卵巢组织观察取其卵巢，去除卵巢表面的脂肪组织，10甲醛液固定，酒精逐级脱水，透风，浸蜡包埋，5m切片，HE染色，光镜观察。内皮细胞观察水合氯醛注入腹腔，将大鼠主动脉从主动脉根部至骼总动脉分叉处取出，剥离外层结缔组织，从腹侧而纵行剥开，生理盐水冲洗
11、干净，戊二醇初固定后，4冰箱中保存备用。戊二醇PBS固定液4 0C固定2h，PBS缓冲液4洗涤2次；再以1锇酸PBS固定液40C固定2h、PBS缓冲液漂洗2次；70100梯度酒精、丙酮顺序脱水；Epon812包埋剂常规电镜包埋，LKBV型超薄切片机切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅双重染色各10min，制备透射电镜标本，采用透射电镜观察并拍照。统计学分析采用统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验。2 结果体重变化处理前各组体重差异无显着性。给药后，模型组实验后体重比正常对照组体重明显增加，差异有显着性；中药组低于模型组，但差异无显着性。阴道脱落细胞观察处理前各组动物的阴道涂片均有明显的性周期
12、变化。约第10天左右完成HCG给药后，模型组动物阴道脱落细胞持续角化，性周期变化基本消失，其中7只大鼠呈典型间情期表现。正常对照动物维持规律性的动情周期，可见阴道分泌物拉丝现象。中药组5只动物维持规律性的动情周期，卵巢形态学观察卵巢大体解剖学改变正常对照组卵巢色泽红，表面多个红点或紫点；模型组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。中药组部分表面苍白，部分表面见红紫色斑点。卵巢光镜检查正常对照组见黄体及不同发育阶段的卵泡，卵泡内颗粒细胞多为56层，形态完整，排列整齐，卵泡腔内可见卵丘、卵细胞、放射冠、透明带结构。模型组囊性扩张的卵泡增多，其卵泡内卵母细胞或放射冠消失，颗粒细胞层数减少至
13、12层，排列紊乱，间质纤维组织增生明显，卵泡膜层增厚，黄体组织数量明显比正常对照组减少，有50(5/10)的卵巢未见黄体形成。中药组60的卵巢见黄体，黄体数量比模型组明显增多，颗粒细胞多为46层，形态完整，排列整齐。内皮细胞透射电镜观察正常对照组主动脉内皮细胞扁平完整，沿血管长轴排列，内皮连续性完好，其相邻内皮细胞相互重叠呈紧密接合，内皮细胞质较少，内皮细胞下连接紧密、间隙窄，内皮细胞完整，线粒体、粗面内质网、光滑内质网结构清晰。模型组主动脉内皮细胞收缩，内皮细胞间的连接失去正常形态，连接局部开大，基底膜不连续，细胞膜损伤、不完整；胞质内空泡明显增多，线粒体膨胀，嵴溶解、断裂、消失；细胞核聚集
14、，异染色质增多。中药组主动脉内皮细胞间连接较紧密，线粒体无明显肿胀，嵴清晰，吞饮泡和溶酶体增多，胞质偶见空泡。血生化指标比较血清FSH、LH、T、INS变化模型组的血清LH、T、INS比正常对照组增高，差异有显着性，FSH降低，但差异无显着性。中药组与正常组比较，差异无显着性；与模型组比较LH明显降低，T、INS降低不明显，FSH增高，但差异无显着性。表1 血清内分泌指标比较血浆PAI1、ET水平变化模型组血浆PAI1、ET比正常对照组增高。中药组与正常组比较，PAI1水平无显着差异，ET增高；较模型组ET、PAI1降低。表2 血浆PAI1、ET水平变化3 讨论 研究发现内皮功能障碍可导致高血
15、压、糖尿病或糖耐量异常及血脂紊乱等代谢性疾病发生和聚集，过量胰岛素与细胞因子和生长因子相互作用促使动脉粥样硬化发展2。内皮功能障碍是胰岛素抵抗综合征的一个独立组成部分3。ET是内皮源性收缩因子中研究最多且被认为是最强的血管收缩剂之一，是血管内皮损伤性疾病的共同致病因子，被公认为反映EC损伤的特异性首选指标，目前尚未见ET与多囊卵巢综合征关系的报道。PAI1是纤溶系统的重要组成成分，在血管内皮细胞合成释放，是一个重要的独立的心血管疾病危险因素4，与IR密切相关。纠正胰岛素抵抗导致的纤溶系统活性异常，也是预防IR合并心血管疾病的重要环节。Glueck等6认为，PCOS患者的各种症状可能与其血纤溶能力有关，PAI1的活性与PCOS患者的流产率呈正相关。 现代研究发现VEC损伤与血瘀证密切相关，活血化瘀药物抗内皮细胞损伤的作用是得到公认的。赵建宏等7采用盐酸肾上腺素制剂复制大鼠VEC损伤模型，观察活血化瘀中药对VEC功能的影响，结果表明：活血化瘀中药能减少VEC损伤所致的脱落，增强VEC的抗凝、抗聚功能，具有良好的VEC保护作用。王青8报告血府逐瘀汤能明显降低血瘀模型兔血浆ET的含量、升高PGI2的含量，并且可增强tPA活性，对PAI活性具有抑制作用，但对正常兔的以上指标没有影响，说明血府逐瘀汤具有调节内皮细胞分泌功能的作用。 本研究表
