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1、浅论CFL2基因半定量多重RT【摘要】 目的 在CFL2基因功能的研究中，建立一种能检测CFL2基因mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系。方法 细胞总RNA经反转录合成cDNA，以GAPDH为内参与CFL2进行同管扩增，以常规PCR体系为参照对退火温度、Mg2+、dNTP和循环数等参数进行优化并与常规组比较,建立了检测C2C12细胞CFL2基因半定量多重RTPCR体系。结果 CFL2和GAPDH的cDNA同时PCR扩增后电泳条带清晰，与预期产物大小一致，两对引物间无明显竞争，其扩增效率和特异性与单一基因的RTPCR体系相同。结论 成功建立CFL2基因半定量多重RTPCR方法，有利于半定
2、量检测CFL2 mRNA表达变化。【关键词】 CFL2基因;半定量RT-PCR;检测方法Abstract: Objective To establish a semi-quantitative multiple RT-PCR method for the measurement of mRNA level in CFL2 gene. Methods cDNA was synthesized with total cell RNA by reverse transcription and amplified together with PCR primers of CFL2 and GAPDH
3、(as internal control) genes. In this system, the annealing temperature, Mg2+ and dNTP concentrations, and cycle number were optimized with reference to the conventional PCR system. Results The result showed that the electrophoresis bands of CFL2 and GAPDH cDNA amplified together by PCR were all clea
4、r and their sizes were expected. In our RT-PCR system, there was no obvious competition of amplification between primer sets and the efficiency and specificity of amplification were identical with those in simple gene RT-PCR system. Conclusions A semi-quantitative multiple RT-PCR method was establis
5、hed successfully which would be beneficial to measure the expression level of CFL2 mRNA.Key words :CFL2 gene; semi-quantitative RT-PCR; detection method人类基因组计划的完成,标志着人类进入了后基因时代。在研究不同实验条件下特异基因表达水平的差异时,半定量RT-PCR检测方法因其成本低、操作简便、普通实验室容易做到,对设备和研究者要求低等特点而被经常使用,尽管目前已有许多改进的检测方法和技术用于定量分析mRNA表达量,但实际上多数研究的焦点并不是
6、检测转录水平微小的变化或确切的分子数目,而是检测其表达水平变化是否显着(至少增加或减少倍以上) 1。只要对相关参数通过正确的实验并进行合适的控制,半定量RT-PCR完全可以反映基因的表达水平1-519-25。Cofilin2(CFL2 or muscle-type cofilin)基因是一个与肌肉肉质密切相关的基因，CFL2基因高表达对细胞内某些肌球蛋白重链基因的表达有明显影响，推测CFL2基因可能与猪的不良肉质性状相关从而导致猪肉的品质下降,肉多汁性减少,口感变差。 本文将以GAPDH基因作为内参基因，同管扩增CFL2和GAPDH，通过实验建立一种检测CFL2基因表达水平的半定量方法，为研究
7、CFL2基因表达提供参考。1 实验材料与方法细胞及主要试剂 C2C12 细胞株购于北京中国协和医科大学细胞中心;胎牛血清(FBS)和Trizol分别购自Hyclone和 Invitrigen公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) 反转录试剂盒;引物由大连宝生物公司合成。C2C12细胞总RNA的提取 利用Trizol法对总RNA进行抽提,DEPC水溶解,用核酸分析仪测定260、280和310 nm波长处OD值,观察RNA完整性和有无降解及基因组DNA污染。反转录 按照TaKaRa公司AMV反转录试剂盒说明书进行,选择RNA纯度高完整性好的RNA样品转录15管,以保证对RT-PCR体
8、系优化过程中拥有含量一致模板。引物的选择与Tm值的确定 PCR引物使用软件进行设计,由大连宝生物公司合成。为控制引物对之间的竞争，CFL2引物两对(F1,F2)，GAPDH一对(Fc)。引物序列F1 sense：5-TACGATGCCACATACGAAAC-3(); Antisense：5-AAGGGAAACTACAACACTGCC-3(Tm)，产物长度231 bp;F2 sense： 5-ATCTTGGTGGGTGACATTGG-3(Tm);Antisense：5-CAAGGGAAACTACAACACTGC-3(Tm)，产物长度322 bp;GAPDH sense：5- GCAGTGGCAA
9、AGTGGAGATT-3(Tm );antisense：5-TGAAGTCGCAGGAG ACAACC-3(Tm)，产物长度789 bp。首先分管进行单一基因的PCR梯度实验,使用常规反应体系(表1)验证引物的特异性并对退火温度进行初步摸索,设计 , , ,59 四个温度(见图1),电泳结束后所有结果均用GeneTools(SynGene)软件进行灰度值分析。表1 常规RT-PCR反应体系试剂名称用量PCR反应条件优化 以cDNA 为模板同管扩增CFL2和GAPDH，分别对Mg2+、dNTP、退火温度、循环数等条件进行优化,优化方法参照Maria Marone119-25、卢建雄16-18、陈
10、超24-26等,本实验仅对优化过的参数与常规组进行比较。张俊峰,等：CFL2基因半定量多重RT-PCR检测方法的建立辽宁医学院学报 2009年12月，30(6)2 结 果CFL2和GAPDH分别进行PCR扩增及Tm的初步选择 由图1可见所设计的3对引物,特异性注:a，b，c，d分别表示58、 4个温度梯度;M表示100 bp的Marker;1和2分别表示322 bp和231 bp大小的CFL2基因;3表示GAPDH基因图1 CFL2和GAPDH分别进行PCR扩增的结果较好，无拖尾和引物二聚体出现;GAPDH的产物量随退火温度的升高而增加,322 bp的CFL2片段在 产物量最多;231 bp的
11、CFL2片段在产物量最多。CFL2和GAPDH多重RT-PCR条件的优化多重PCR的Mg2+和dNTP优化 由图2可见，在对CFL2和GAPDH进行同管扩增时,由于231 bp的CFL2引物与GAPDH引物或是与模板间发生了不可预测的杂交配对,所以将该对引物舍弃;在对Mg2+和dNTP进行优化后,优化组322和789 bp的条带均高于正常组,因此在半定量RT-PCR检测体系中Mg2+和dNTP的浓度分别以 mmol/L和 mmol/L为宜。注:a，b分别表示对Mg2+与dNTP优化后的优化组和常规组;M表示100 bp的Marker;1为322 bp的CFL2与GAPDH同管PCR扩增结果;2
12、为231 bp的CFL2与GAPDH同管PCR扩增结果图2 多重PCR扩增CFL2和GAPDH的结果注:a,b,c分别表示、56 3个温度梯度;M表示100 bp的Marker;1为常规引物浓度,2为优化后的引物浓度;小数值表示CFL2/GAPDH的灰度值图3 引物浓度和退火温度的比较多重PCR的引物浓度和退火温度的确定 由图3中各组分的灰度值可知,当退火温度为 ,CFL2引物浓度为 mM,GAPDH引物浓度为 mM时，与常规组(Mg2+和dNTP已优化)的引物浓度 mM进行比较,扩增效率明显增高,最终确定小鼠CFL2基因半定量体系和反应条件如下(表2)。表2 CFL2和GAPDH多重RT-P
13、CR优化的反应体系试剂名称用量(L)RT-PCR反应程序10buffer(Mg2+free)预变性:945 mindNTPs(2mM)变 性:9430sMgCl2(25mM)复 性:30sCFL2 sense 延 伸:7245sCFL2 antisensesenseantisense 共30个循环再延伸:7210 minTaq DNA聚合酶保 存4加超纯水至总体积20 L3 讨 论RT-PCR是一种常用的具有很高灵敏度和特异性的检测方法，只要对PCR反应参数通过正确的实验并进行合适的控制,半定量RT-PCR一定程度上完全可以在反映基因的表达水平。在使用半定量RT-PCR方法时应采用同管多重PC
14、R扩增目的基因和内参基因,以保证反应条件和影响因素完全一致,在凝胶成像系统上分析时,所得比值才能真正反应目的基因mRNA的表达水平。如果不同管(分管)扩增目的基因和内参基因，本人认为有以下几个缺点:PCR扩增反应是酶促反应,扩增产物呈指数增长,起始cDNA量的微小差异会引起很大的差异，在不同管进行扩增目的基因和内参基因时很难保证起始的cDNA量一致。采用不同管扩增法时，反应体系和扩增效率难保持一致,点样、加样等人为因素较多。在凝胶成像分析中,由于紫外灯管的质量、光的强度、均一性和CCD距离、焦距、分辨率等因素,分次照相会导致结果差异较大。应用半定量多重RT-PCR同管扩增2个或2个以上基因时,
15、在优化反应体系Mg2的浓度和退火温度等反应参数的基础上，应特别注意以下三方面的问题:循环数 选择合适的循环数是非常重要的。PCR扩增反应最初以线性递增,但随着反应进行，扩增反应将会达到一个平台,半定量RT-PCR对基因丰度值的测定应在对数期进行。引物对间的扩增竞争 为了使同一管中扩增出的内参基因和目的基因清晰可见,除了在设计引物时考虑目的基因和管家基因引物的预期退火温度和大小外,在预实验时还应对CFL2基因和GAPDH基因进行同管和异管扩增,排除发生不可预测的杂交配对、扩增竞争从而影响PCR的扩增的引物。内参选择 半定量RT-PCR检测基因mRNA相对表达水平必须要有在各种条件下表达水平稳定、
16、表达量适中的管家基因作内对照，并且排除可能影响目的基因分析的内参。商品化内参在一些文献中均有表述。总之,经过对反应参数的优化,我们建立了检测CFL2 mRNA表达水平的半定量多重RT-PCR体系,应用该体系得到了GAPDH及CFL2基因清晰的电泳带,扩增效率和特异性与单重PCR体系相同,实验重复性好。因此,该方法和体系可用于快速、灵敏、可靠地检测CFL2 mRNA表达。【参考文献】 1 Marone M ,Mozzetti S,Ritis D D,etRT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sam
