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1、简易真菌分离技术植物病原真菌通常采用组织分离、稀释分离、单孢子分离等技术，这里介绍一种我们在研究工作中摸索出来的方法组织捣碎法，即将寄主植物上形成子囊果、分生孢子器、分生孢子盘或分生孢子角的组织块捣碎，加适量灭菌水，配成菌体悬浮液，再涂抹于培养基平板上生长，最后纯化的方法。 (共1页) 文章关键词: 真菌 分离技术 植物病原菌 组织捣碎法 文章快照:术，这里介绍一种我们在研究工作中摸索出来的方法组织捣碎法，即将寄主植物上形成子囊果、分生孢子器、分生孢子盘或分生孢子角的组织块捣碎，加适量灭菌水，配成菌体悬浮液，再涂抹于培养基平板上生长，最后纯化的方法。一般具有子囊果、分生孢子器、分生孢子盘等结构
2、的真菌肉眼可见呈小黑点状，在解剖镜下更是清晰，但由于这些结构部分埋生于植物组织内，采用直接挑取单个小黑点的方法不仅难以挑出，而且容易污染；观察这类真菌时将有小黑点的小组织块夹于通草内切片的方法，若将组织块直接用双面刀片跺碎，置显微镜下观察时通常会见到组织块内有大量的孢子(子囊孢子或分生孢子)溢出，这就为组织捣碎进行分离纯化提供了可能。从近几年的实践来看，该方法简单易行，得到的纯菌落量多，成功率高，是真菌分离的一种好方法。1所需器具及操作步骤组织捣碎法所需器具：超净工作台，灭菌研钵，70酒精棉球，灭菌水，移液枪(pipette)，三角玻棒，指形烧杯，PDA平板，镊子，酒精灯。分离时，在超净工作台
3、内，把带有小黑点的植物组织块用70酒精棉球擦拭，清除表面杂菌，再将组织块放人装灭菌水的指形烧杯内清洗3次，用灭菌镊子夹取，移人灭菌研钵内，捣碎，加少许灭菌水配成悬浮液，混匀，移液枪吸取2oo1放于PDA平板上，用灭菌三角玻棒推匀，倒置于25温箱内培养。2适应范围该组织捣碎分离方法对许多在寄主组织表面产生小黑点或分生孢子角，用单孢分离法不易操作的真菌都适合，如甘薯长喙壳、苹果黑腐皮壳菌、梨黑星病菌、芹菜斑枯病菌、茄褐纹病菌等许多子囊菌、半知菌的分离纯化，对不产生孢子，只形成菌丝的真菌，如小麦纹枯菌、棉花猝倒病菌等亦适用，但对一些表面污染严重的寄主组织用这种方法则难以得到纯培养物。3主要优点(1)
4、分离得到的纯化菌落量多(由于小黑点内的孢子量大或被捣碎的菌丝段多)，分离的成功率很高。(2)尽管操作需在无菌操作间内进行，但由于所需器具简单，操作简便，而且不易污染，对于初学分离培养者来说，该方法一学即会，易于掌握。(3)对于易失水、易腐烂的叶部真菌病害，特别是所得的病害标本很少，用组织分离等方法难以保证成功获得病原物纯培养物的被分离真菌，尝试此方法大多能达到理想的效果。4注意问题(1)真菌的孢子往往产生在发病较久的病组织上，70酒精棉球擦拭虽可将大部分杂菌清除，但由于配成了菌悬液，需要排除细菌污染，可往三角瓶培养液内加入25乳酸(10lm1)或链霉素(40gm1)混匀后再倒成平板，可以抑制大
5、部分细菌的生长。(2)若操作中没有灭菌过的研钵，可临时改用载玻片，再加一个双面刀片，并在酒精灯火焰上方烧灼灭菌，改捣碎为切碎，吸少量灭菌水冲洗至PDA平板上，也不影响纯菌落的获取。(3)对于病害标本很少的情况，一方面可用上述方法，另一方面可将部分捣碎的菌悬液涂抹于健康的植物叶片上，在适宜条件下让其发病，确保有病害标本的供给。收稿日期：zOO5一Oz一24作者简介：詹刚明(1976一)，湖北省应城市人，在职硕士研究生，主要从事真菌病害研究一、鸡枞的形态特征鸡枞（学名：Termitomyces albuminosus(Berk)Heim）又名鸡宗、鸡松、鸡脚菇、蚁枞等，是云南的著名特产，因肥硕壮实
6、、质细丝白、鲜甜脆嫩、清香可口，可与鸡肉相媲美，故名鸡枞。鸡枞，担子菌纲，伞菌科高营养食用菌。子实体中至大型，刚出土时，菌盖圆锥形，伸展后呈斗笠状，中间有一明显的乳头状突起，菌直径1020厘米，菌盖表面光滑，潮湿时有黏性，前期灰褐色，中期奶油色，后期灰白色，乳突部分深褐色，少数菌有辐射状。撕裂；菌褶白色，肉质厚实。菌柄中生，粗细不等，多肉质，白色或与盖同色，地下部分褐色至黑色，表面平滑，易于开裂，柄长315厘米，直径0.52，基部膨大处可达1.535厘米；假根长1127厘米，以至7080厘米，端部像蚂蝗的吸盘一样，生于菌圃表面。抱子呈卵园形，710.5微米4.5微米,白色或奶油色。二、鸡枞的分
7、布与生态环境鸡枞菌主要分布于亚洲、非洲热带地区；南太平洋岛屿和亚洲的亚热带地区。在我国，鸡枞菌西南、东南几省及台湾的一些地区出产，其中以云南所产为佳。鸡枞菌常见于针阔叶林中地上、荒地上和乱坟堆、包谷地中，基柄与白蚁(Odontotermes sp.)巢相连，散生至群生。夏季高温高湿，白蚁窝上先长出小白球菌，之后形成鸡枞子实体。 1. 鸡枞菌与白蚁营共生生活 在自然条件下鸡枞菌与白蚁营共生生活,与之共生的白蚁是大白蚁亚科的某些种，比较常见的土栖白蚁有黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）、云南土白蚁（O.yunnanesis）、黄翅大白蚁(Macrotermes barne
8、yi)等。（1） 白蚁在建巢中为鸡枞菌传播菌种 。（2） 白蚁又从鸡枞菌的小白球获得各种营养和抗病物质。（3） 鸡枞菌又从白蚁巢菌圃及周围环境获得营养源。2. 蚁巢是白蚁与鸡枞菌共生理想的生态环境 蚁巢多建于地下20100厘米处，体积从0.11.0立方米不等,有中央大巢和分散的卫星巢,之间有蚁道相互连接。蚁群在蚁巢中会长期繁衍答几年至数十年之久，一蚁巢群白蚁个体可达1,000,000210,000,000个（贺新生，1995）。（1）蚁巢内有稳定的生态条件 蚁巢内有稳定的生态条件适宜与白蚁与鸡枞菌共同生存。稳定的温、湿度。pH低而稳定。高浓度的二氧化碳。（2）雨季来临是鸡枞菌形成子实体的有利条
9、件 每年只有当雨季来临时，雨水渗入蚁巢周围的土壤，有利于鸡枞菌菌丝体向外生长。（陈楚） 3. 蚁巢中的生物群体 白蚁巢中存在着许多微生物种群，除以鸡枞菌为主要菌物外，还有细菌、青霉、曲霉等十于种。三、蕴藏量及营养成分 云南是我国鸡枞菌产区，年产达2000吨以上 。由此可知，在我国鸡枞菌的蕴藏量十分巨大。 鸡枞菌含有丰富的营养物质：100g干鸡枞中，含蛋白质28.8g、碳水化合物42.7g、热量286千卡、灰分5.6g、钙23mg、磷750 mg、核黄素1.20mg、尼古酸64.2mg。100克鲜鸡枞中含维生素C 5.41mg。四、鸡枞菌的利用价值1 鸡枞的吃法很多，可以单料为菜、还能与蔬菜、鱼
10、肉及各种山珍海味搭配，可作一般的家常小菜，也可作珍馐供宴会使用。无论炒、炸、腌、煎、拌、烩、烤、焖，还是清蒸或做汤，其滋味都很鲜，被人们推为菌中之冠。 2 鸡枞菌为古今中外颇为赞美的名贵食用菌，有益味、清神、治痔的作用。据本草纲目记载，鸡枞还有益胃、清神、治痔的作用。现代医学研究证明，鸡枞有增强人体免疫功能、预防肠癌、养血、润燥、健脾胃等功效。适用于食欲不振、虚劳怔忡、痔疮下血等。而且它具有丰富营养，对人体有非常好的滋补作用。是体弱、病后和老年人的佳肴，鸡枞有养血润燥功能，对于妇女也很适合。它还具有提高机体免疫力，抑制癌细胞的作用，并含有治疗糖尿病的有效成分，并对降低血糖有明显效果。3加工菌油
11、 菌油是我国民间对食用菌进行保藏的一种方法。加工成的菌油多被作为家厨的调味用品。鸡枞菌菌油的加工方法是：鲜鸡枞菌5千克，洗净切片沥干，菜油2.5千克倒入锅中旺火烧沸，再放入花椒30克，干辣椒片150克，八角100克，显黄色时捞起，装入瓶中以原油浸泡，封盖后贮存。其颜色红褐，脆而不焦，香甜麻辣，为油菌中的佳品，也是我国西南地区值得开发利用的菌类调料佳品（陈启武等，1999）4 干制和盐浸，产品除供鲜销外还可以加工成干制品或盐浸菇。干制时将清洗干净的鲜菇按个体大小分别晒干，也可将菌柄和菌盖切开晒七八成干，再用电热（或木炭）在55-60C下烘至全干。盐浸时可将鲜菇放入冷盐水（浓度为0.6%，过浓菇体
12、会发红）浸泡20分钟，捞起后按每100千克鲜菇加24千克盐的比例装缸，装一层菇，撒一层盐，装满后注入煮沸后冷却的饱和盐水至缸面，再按每一百千克菇加一百克柠檬酸，浸泡七天后翻缸一次，14天后即可分装。在腌制过程中，用手指蘸取盐水，略干后指上有一层盐霜为宜（赖井平，1993）5利用液体深层发酵研制营养食品及饮料 液体培养的鸡枞菌菌丝体，其蛋白质含量高过其他多种食用菌的蛋白质含量，且人体8种必须氨基酸尤其是主粮中缺少的赖氨酸和亮氨酸的含量都很高。因此，利用液体深层发酵研制鸡枞菌的营养食品和营养饮料，具有广阔的应用前景。陈楚等（1991）利用鸡枞菌连续发酵生产营养酱油，取得良好的效果，产品质量高中山大
13、学生物系（钟恒等，1992）利用液体深层发酵研制成的鸡枞菌发酵营养饮料，其最大的特点是易被肠胃和细胞快速吸收，从分利用；又有医疗保健的功效；很适合危重病人、体质虚弱者、老人、孕妇等的饮用。五、鸡枞菌的栽培及繁殖方法1 菌丝体的液体培养液体深层培养的研究和菌丝体化学成分的分析华西医学大学生物系（赵呈裕等，1988）曾对鸡枞菌采用不同培养基进行液体深层培养的研究，并对所培养的菌丝体进行成分的分析，其要点及结果如下：所用菌种系采自四川西昌，经组织分离并经提纯获得的菌株。所用的液体培养基配方为：蛋白胨2%，蔗糖2%，硫酸镁1.5%，磷酸二氢钾0.3%，维生素B1每100毫升1毫克。酵母膏0.1%，蔗糖
14、3，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.1，硝酸钠0.3%，氯化钾0.05%。多胨2%，其余同配方1。以上各配方PH调至6。三种液体培养基配方，灭菌后接入液体菌种，接种量为10%，在温度26，振荡速度为110转/分的条件下振荡培养36小时后测定菌丝体干重，测定结果是配方的菌丝干重为805克/升，配方为11.5克/升，配方为10克/升。再继续培养24小时，生物量开始下降。 收集干菌丝体进行化学成分分析，测定结果是：蛋白质含量49.2%，脂肪805%，碳水化合物10.8%，灰分3.9% ，钙每100克36.8毫克，磷每100克15.0毫克。每100克干品中含18种氨基酸，总量为31.76克，其中人体8
15、种必须氨基占15.15克。在18种基酸中，含量最高的是谷氨酸为3.29克，其次是异亮氨酸3.23克，再次是天门冬氨酸2.59克。2 人工栽培：纯种的分离和培养 母种 分离的培养基配方为：马铃薯200克，蚁巢20克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。灭菌接种后在181下培养286小时，菌丝长满管。菌丝浓密，粗壮，洁白，匍匐型（赖井平，1993）。 原种，栽培种 比较适宜的培养基配方：1阔叶树木屑78%，麸皮20%，蔗糖1%，石膏1%，料与蚁巢浸出液之比为1：1.2。灭菌后接入母种块2平方厘米，在181恒温培养，63天菌丝长满瓶，菌丝浓密，较壮。2木屑100千克，麸皮25千克，蚁巢土25千
16、克，石膏1千克，糖1千克，料水比1：1.2，灭菌后接入母种块约2平方厘米，在181恒温培养，60天菌丝长满瓶，菌丝浓密，健壮（12赖井平，1993）。 菌种保藏 鸡枞菌菌丝体在温度低于8的条件下，停止生长，甚至死亡，因此，不适合在冰箱低温保藏，一般多采用常温保藏，具体做法是，按上述原种培养基配方，装料时要比平常稍微紧些，灭菌后接入母种，在18左右培养，当菌丝向下吃料至45厘米时，用牛皮纸包好棉塞，套上干净纸袋，置阴凉保存，可保存58个月。：子实体的培育栽培季节的安排 以春季栽培为益，在蜀南竹海地区34月份气温在1218，是鸡枞菌菌丝体生长最适宜温度范围，此时制袋接种，不许加温，成功率高，待4050天菌丝长满袋，气温回升可埋入
