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1、免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅 （二）、试 剂1. PBS缓冲液（ph7.27.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.20.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。30.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：
2、在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。6. 3%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.09.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8TBS/PBS PH9.09.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本 （三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。 a 组
3、织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟 b 无水乙醇中浸泡五分钟 c 95%乙醇中浸泡五分钟 d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复 a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95左
4、右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2. Bax. AR. PR. C-fos. x-jum. z-kit. c-myc. E-cadherin. ChromograninA. Cyclin. ER. Heatshock. Protein. HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B 酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37，消化时间约
5、为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟 （4）PBS洗2-3次各5分钟 （5）抗原修复（6）PBS洗2-3次各5分钟 （7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（9）4过夜后需在37复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加抗45-50l,室温静置或371小时（12
6、）抗中可加入0.05%的 tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 （15）PBS或自来水冲洗10分钟 （16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟 （18）脱水、透明、封片、镜检。4、SABC法（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2次各5分钟 （3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5） PBS洗5分钟 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加抗50l,室温静置1小时或4过夜或371小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物
7、素化抗，20-37 20分钟（10）PBS洗3次各2分钟 （11）滴加试剂SABC 20-30 20分钟（12） PBS洗4次各5分钟 （13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色（14）脱水、透明、封片、镜检。 免疫组化问题解答1、染色过强a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长c 组织
8、中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间3、染色弱a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释 （应防止切片干燥）d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟4、染色阴性a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误 免疫组化操作要点及技巧（1）固定：
9、最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。（2）组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。（3）切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开
10、，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。（4）烤片：60 30分钟或37 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。（5）蜡块及切片的保存：最好在4保存（6）脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。（7）灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系
11、统：3%HAc灭活。（8）暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。（9）封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭（10）抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。（11）背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1 Tween20的PBS洗，特别
12、是在显色之前要多洗。（12）返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。（13）显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。（14）在整个操作过程中，切片千万不能干燥，否则会有非特异性染色。（15）拍照1)更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。2)数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉3)免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅
13、，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。免疫组化技术的关键问题1.组织处理恰当的组织处理是做好免疫组化染色的先决条件，也是决定染色成败的内部因素，在组织细胞材料准备的过程中，不仅要求保持组织细胞形态完整，更要保持组织细胞的抗原性不受损或弥漫，防止组织自溶。如果出现自溶坏死的组织，抗原已经丢失，即使用很灵敏的检测抗体和高超的技术，也很难检出所需的抗原，反而往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，在上述区域易出现假阳性结果。1) 组织及
14、时取材和固定组织标本及时的取材和固定是做好免疫组化染色的关键第一步，是有效防止组织自溶坏死，抗原丢失的开始，离体组织应尽快的进行取材，最好2h内，取材时所用的刀应锐利，要一刀下去切开组织，不可反复切拉组织，造成组织的挤压，组织块大小要适中，一般在2.5cm2.5cm0.2cm，切记取材时组织块宁可面积大，千万不能厚的原则，(也就是说组织块的面积可以大到3cm5cm，但组织块的厚度千万不能超过0.2cm，否则将不利于组织的均匀固定)。固定液快速渗透到组织内部使组织蛋白能在一定时间内迅速凝固。从而完好的保存抗原和组织细胞形态。对于固定液的选择，原则上讲，应根据抗原的耐受性来选择相应的固定液，但除非
15、是专项科研项目，在病理常规工作很难做到这一点，因为病理的诊断和鉴别诊断都是在常规HE病理诊断的基础上决定是否进行免疫组化的染色，而HE染色的常规组织处理是采用10%的中性缓冲福尔马林或4%缓冲多聚甲醛4倍于组织体积进行组织固定，利用其渗透性强，对组织的作用均匀进行固定，但组织固定时间最好在l2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。2) 组织脱水、透明、浸蜡组织经固定后进行脱水、透明、浸蜡和包埋。掌握的原则是脱水透明要充分但不能过，浸蜡时间要够，温度不能高，否则造成组织的硬脆使组织切片困难，即使能切片，由于组织的硬脆，也使切片不能完好平整，染色过程中极易脱片，对免疫组化染色抗原的定位及背景都不利，所以无水酒精脱水和二甲苯透明的时间不宜过长，正常大小的组织无水酒精脱水lh3次，二甲苯透明lh2次即可，浸蜡及包埋石蜡温度不要超过65。2.切片组织得到很好处理后在进行切片之前还应对玻璃片进行处理，由于我们检测抗原是多种多样的，因染色操作程序复杂，时间较长，有些抗原是要进行各种抗原修复处理，如微波、高压、水溶酶等，玻片如果得不到很好的处理，将易造成脱片，为保证免疫组化实验的正常进行，要求在贴片前对载玻片作适当
