《安非他明对小鼠白细胞介素10释放的影响及多巴胺d3受体的调控作用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《安非他明对小鼠白细胞介素10释放的影响及多巴胺d3受体的调控作用.docx（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 安非他明对小鼠白细胞介素10释放的影响及多巴胺D3受体的调控作用 作者：陈艳炯，朱俊艳，张洪波，魏曙光，阎春霞，郑海波，任会勋，陈腾 【摘要】 目的 研究安非他明(AM)对细菌脂多糖(LPS)刺激后小鼠白细胞介素10(interleukin10, IL10)释放的影响以及多巴胺D3受体在此过程中参与的调控作用。方法 实验：采用多巴胺D3受体基因敲除小鼠(D3RKO)以及具有相似遗传背景的野生型小鼠(C57BL/6J)，腹腔注射AM(5mg/kg)10min后再注射LPS(150g/kg)刺激，在LPS给药后不同时间点(0、30、60、90、120、240min)心脏穿刺抽血进行IL10测试，
2、观察上述不同时间点D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10的分泌情况。实验：在实验所确定的小鼠IL10分泌最高时间点，观察不同剂量AM (0、2、5、10mg/kg) 对D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10分泌的影响。结果 实验：AM 5mg/kg在LPS注射后可以引起D3RKO和C57BL/6J小鼠IL10分泌增多，其中60min达最大值，与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(P 【关键词】 安非他明 白细胞介素 10 多巴胺D3受体 细菌脂多糖 基因敲除小鼠 ABSTRACT: Objective To study the effects of amphetamine (AM) adm
3、inistration on the production of interleukin10 (IL10) following an intraperitoneal injection (ip) of bacterial lipopolysaccharide (LPS, 150g/kg) in mice and the role of dopamine D3 receptor involved in it. Methods In section : dopamine D3 receptor knockout mice (D3RKO) and wild type mice (C57BL/6J),
4、 both exhibited a similar genetic background, received either vehicle(normal saline, NS) or AM (5mg/kg ip) 10min prior to LPS (150g/kg) in vivo immune challenge, were sacrificed 0, 30, 60, 90,120, or 240min later by anesthetized with sodium pentobarbital; in section: C57BL/6J and D3RKO mice received
5、 AM at different dose (0, 2, 5, 10mg/kg) 10min prior to either vehicle or LPS, and were sacrificed 60min later. In anesthetized mice, blood was collected via cardiac puncture using a syringe without an anticoagulant. IL10 of serum was measured by means of commercially available enzymelinked immunoso
6、rbent assay. Results In section : under the treatment of AM, the greatest effect was observed at 60min after LPS challenge in both C57BL/6J and D3RKO mice. In section: the administration of AM at dose of 5mg/kg significantly increased LPSinduced IL10 production in C57BL/6J mice, but significantly in
7、creased LPSinduced IL10 production at dose of 2mg/kg in D3RKO mice, versus other doses of AM (P KEY WORDS: amphetamine; interleukin10; dopamine D3 receptor; lipopolysaccharide; knockout mice 研究表明，药物滥用可导致动物胸腺和脾脏萎缩、淋巴细胞数目及亚群减少、细胞因子含量改变等，可卡因、鸦片、大麻和安非他明(AM)等毒品的滥用可能直接或通过神经免疫途径间接损伤免疫功能。白细胞介素10(interleukin
8、10, IL10)是重要的免疫调节因子，又名细胞因子合成抑制因子。CONNOR1报道如没有细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的刺激IL10几乎检测不到，因此认为生理状态下IL10的分泌量极低。LPS作为外源性致炎物质能够有效地激活单核巨噬细胞上的Toll样受体(Tolllike receptor, TLR)，从而引起IL10合成和释放2。研究AM对LPS刺激下IL10含量的影响，可能对研究AM依赖者免疫功能抑制的机制具有一定意义。 既往研究表明，安非他明等药物产生依赖与大脑多巴胺系统密切相关，多巴胺D3受体(dopamine 3 receptor, D3R)在AM依赖
9、形成过程中发挥了重要作用。据此我们推测，AM对机体免疫功能的抑制作用也有可能与中枢多巴胺系统有关。因此本研究采用多巴胺D3受体基因敲除小鼠(dopamine 3 receptor knockout, D3RKO)为对象，以IL10为观察指标，研究AM对小鼠IL10的分泌的影响以及多巴胺D3受体参与的作用，旨在为进一步研究AM依赖对机体免疫的影响机制奠定基础。 1 材料与方法 实验动物 D3RKO小鼠(美国芝加哥大学徐明教授馈赠，遗传背景见文献3，为C57BL/6Jsv129)和具有相似遗传背景的野生型(wildtype, WT)C57BL/6J小鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供)各56只
10、，体重(202)g，雌雄各半，随机分为实验(24只)和实验(32只)。实验动物饲养在SPF级动物房，层流架中分笼饲养，每笼3只，室温(223)，1212h昼夜循环非直接光照条件下生活，自由进食水。 实验药品及配制 硫酸安非他明粉剂(中国生物制品研究所),实验前用9g/L灭菌生理盐水稀释为、/mL，应用剂量为2、5、10mg/kg体重；细菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(L2654，大肠杆菌血清型O26：B6)购自Sigma公司，在1mg包装瓶中加入1mL生理盐水制成1g/L的贮备液，-20保存，临用时稀释为15mg/L，应用剂量为150g/kg体重；IL10双抗体夹心
11、ELISA检测试剂盒，为奥地利Bender Medsystems Diagnostics GmbH公司产品；戊巴比妥钠粉剂由国药集团化学试剂有限公司生产，批号：F20171117，称取戊巴比妥钠50mg溶解于20mL生理盐水制成/L的工作液，应用剂量为25mg/kg体重。每种溶剂每次腹腔注射剂量均为10mL/kg。 实验方法 实验：AM对LPS给药后不同时间点小鼠IL10分泌的影响 C57BL/6J和D3RKO小鼠腹腔注射(intraperitoneal injection, ip)生理盐水(NS)或AM(5mg/kg)后10min再ip NS(0min)或LPS(150g/kg)(根据参考文
12、献6药物的等效剂量关系得出)，在ip LPS后30、60、90、120、240min(n=2)分别处死小鼠收集血液。用/L戊巴比妥钠溶液(10mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠，打开胸腔采集心血，注入有抗凝剂(/L EDTA，50L)的EP管中，立即在4 2500r/min离心15min，吸取上清分装，-80保存备ELISA检测用。 实验：不同剂量AM对C57BL/6J和D3RKO小鼠IL10分泌的影响 基于实验中LPS注射后60min血中IL10的含量最高的结果，本组实验选择LPS注射60min后处死小鼠采集心血。C57BL/6J和D3RKO小鼠分为4组：NS组(对照组，n4)和AM 2、5、10
13、mg/kg组(n4)，ip NS或AM后10min再分别用NS或LPS(150g/kg)激发，60min后处死小鼠采集心血。余同实验。 IL10的检测 小鼠血清IL10的检测按照操作说明书进行。 统计学分析 实验数据以(s)表示，应用SPSS 统计软件行单因素方差分析(oneway ANOVA)。不同药物处理组(AM、LPS和NS)、鼠的基因型和AM各个剂量组之间为组间变量，如有差异，采用Fishers LSD进行post hoc多重比较。以P 2 结 果 AM对LPS给药后不同时间点小鼠IL10分泌的影响 C57BL/6J小鼠ip NS、AM 5mg/kg后10min给予外源性LPS(150
14、g/kg)诱导，结果显示注射AM和NS小鼠间血中IL10的含量有统计学差异F(1,23)=, P，图1。 不同剂量AM对C57BL/6J和D3RKO小鼠IL10分泌的影响 在C57BL/6J小鼠ip NS和AM 2、5、10mg/kg后10min给予外源性NS和LPS(150g/kg)诱导，结果显示AM各剂量间IL10含量有统计学差异F(3,31)=, P。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示AM 5mg/kg给药后IL10分泌最多。刺激物NS和LPS之间也有显著性差异F(1,31)=, P，图2A。 在D3RKO小鼠ip NS和AM 2、5、10mg/kg后10min给予外源性NS和LPS(150g/kg)诱导，结果显示AM各剂量之间有差异F(3,31)=, P。进一步做最小显著差异(LSD)多重比较，显示AM 2mg/kg给药后IL10分泌最多。刺激物NS和LPS之间也有显著性差异F(1,31)=, P；但C57BL/6J和D3RKO小鼠之间没有统计学差异F(1,631 / 1
