显微镜介绍,原理.doc

《显微镜介绍,原理.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《显微镜介绍,原理.doc（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、显微镜显微镜一般分为：光学显微镜、电子显微镜、探针显微镜1.光学显微镜：图1-1-1现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。结构为：目镜，镜筒，转换器，物镜，载物台，通光孔，遮光器，压片夹，反光镜，镜座，粗准焦螺旋，细准焦螺旋，镜臂，镜柱，是显微镜的基本组成单位，主要是保证光学系统的准确配制和灵活调控，在一般情况下是固定不变的。而光学系统由物镜、目镜、聚光器等组成，直接影响着显微镜的性能，是显微镜的核心。一般的显微镜都可配置多种可互换的光学组件，通过这些组件的变换可改变显微镜的功能，如明视野、暗视野、相差等。光学显微

2、镜的原理：当一束平行于光轴的光线通过凸透镜后相交于一点，这个点称焦点，通过交点并垂直光轴的平面，称焦平面。焦点有两个，在物方空间的焦点，称物方焦点，该处的焦平面，称物方焦平面；反之，在象方空间的焦点，称象方焦点，该处的焦平面，称象方焦平面。 1. 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象； 2. 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；3. 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；4. 当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；5. 当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无

3、象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。这是凸透镜成像的基本原理，把物镜与管镜合称为物镜，将这两种镜片看做一组组合透镜，就可以得到如图的简化光路图dL图1-1-2即，物体AB位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外，在象方二倍焦距以外形成了放大的倒立实象A1B1而这个实像落在了目镜的焦点以内，就在物体的同侧形成了一个放大的“正立”的虚像，因为目镜放大的并不是物体而是由物镜放大后的倒立实像，因此我们得到的就是相对与原物体的倒立放大的虚像。显微镜对物体的放大，实际上就是对人观察物体时视角的放大，因此显微镜的放大率取决于对视角的放大率如果有一台显微镜，物镜焦距为，目镜焦距为，镜筒长L

4、，若最后的像成在离目镜d处，试证明显微镜的放大率。显微镜的光路如图1-1-2所示，AB经物镜成一放大实像，物镜的长度放大率 因、相对L都较小。而且B很靠近，所以，即 位于目镜的焦点内，经目镜成一放大的虚像（通常让成在观察者的明视距离d上）。因为都是近轴光线，所以此时观察者从目镜中看到的视角为 若观察者不用显微镜，直接观看AB的视角为 则显微镜的放大率m 不难看出目镜的长度放大率为 所以有 显微镜的重要光学技术参数显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况

5、来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。1 数值孔径数值孔径简写NA，数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2孔径角又称镜口角，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物

6、镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的溴萘作介质，溴萘的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指出，为了充分发挥物镜数值孔径的作用，在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值。数值孔径与其他技术参数有着密切的关系，它几乎决定和影响着其他各项技术参数。它与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。2 分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，又称鉴别率。其计算公式是=/NA式中为最小分辨距离；为光线的波长；

7、NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小值，可采取以下措施（1） 降低波长值，使用短波长光源。（2） 增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3） 增大孔径角u值以提高NA值。（4） 增加明暗反差。3 放大率和有效放大率由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率1的乘积：=1显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相

8、信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。有关系式：500NA1000NA当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。 4 焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平

9、面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层，焦深与其他技术参数有以下关系：（1） 焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。（2） 焦深大，分辨率降低。 由于低倍物镜的景深较大，所以在低倍物镜照相时造成困难。在显微照相时将详细介绍。5 视场直径（Field Of View）观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场，它的大小是由目镜里的视场光阑决定的。视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。有公式 F=FN/式中F: 视场直径，FN：视场数（

10、Field Number, 简写为FN，标刻在目镜的镜筒外侧），:物镜放大率。由公式可看出：（1） 视场直径与视场数成正比。（2） 增大物镜的倍数，则视场直径减小。因此，若在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，而换成高倍物镜，就只能看到被检物体的很小一部份。6 覆盖差显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求

11、的盖玻片的厚度。 7 工作距离WD工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。物镜物镜是显微镜最重要的光学部件，利用光线使被检物体第一次成象，因而直接关系和影响成象的质量和各项光学技术参数，是衡量一台显微镜质量的首要标准。1 物镜的主要参数（1） 放大率（2） 数值孔径NA（3） 机械筒长L：在显微镜中，物镜支承面到目镜支承面之间的距离称为机械筒长。对于一台显微镜来说，机械筒长

12、是固定的。我国规定机械筒长是160毫米。（4） 盖玻片厚度d（5） 工作距离WD这些参数，大多刻在物镜筒上，如图3所示。有一种所谓筒长无限的显微物镜，这种物镜的后方一般带有辅助物镜（也叫补偿物镜或镜筒物镜），被观察物体位于物镜前焦点上，经过物镜以后，成像在无限远，再经过辅助物镜成像在辅助物镜的焦平面上，如图4所示。在物镜和辅助物镜之间是平行光，所以中间距离比较自由一些，可以加入棱镜等光学元件。 物镜的基本类型（1） 按显微镜镜筒长度（以mm计）：透射光用160镜筒，带0.17mm厚或更厚的盖玻片；反射光用190镜筒，不带盖玻片；透射光与反射光用镜筒，筒长无限大。（2） 按浸法特征：非浸式(干式

13、)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。（3） 按光学装置：透射式、反射式以及折反射式。（4） 按数值孔径和放大倍数：低倍(NA0.2与10X)，中倍(NA0.65与40X)，高倍(NA0.65与40X)。（5） 按校正象差的情况不同，通常分为消色差物镜，半复消色差物镜，复消色差物镜，平视场消色差物镜，平视场复消色差物镜和单色物镜。a. 消色差物镜（Achromatic objective）这是应用最广泛的一类显微物镜，外壳上常有Ach字样。它校正了轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（黄绿光）和正弦差，保持了齐明条件。轴外点的象散不超过允许值(4属光度)，二级光谱未校正。数值孔径为0.10

14、.15的低倍消色差物镜一般由两片透镜胶合在一起的双胶物镜构成。数值孔径至0.2的消色差物镜由两组双胶透镜构成。当数值孔径增大到0.3时，再加入一平凸透镜，该平凸透镜决定着物镜的焦距，而其它透镜则补偿由其平面与球面产生的象差。高倍物镜的平面象差可用浸法消除。高倍消色差物镜一般均为浸式，由四部分构成：前片透镜、新月形透镜及两个双胶透镜组。b. 复消色差物镜（Apochromatic objective）这类物镜的结构复杂，透镜采用了特种玻璃或萤石等材料制作而成，物镜的外壳上标有Apo字样。它对两个色光实现了正弦条件，要求严格地校正轴上点的位置色差（红，蓝二色）、球差（红，蓝二色）和正弦差，同时要求

15、校正二级光谱（再校正绿光的位置色差）。其倍率色差并不能完全校正，一般须用目镜补偿。由于对各种象差的校正极为完善，比响应倍率的消色差物镜有更大的数值孔径，这样不仅分辨率高，象质量优而且也有更高的有效放大率。因此，复消色差物镜的性能很高，适用于高级研究镜检和显微照相。c. 半复消色差物镜（Semi apochromatic objective）半复消色差物镜又称氟石物镜，物镜的外壳上标有FL字样。在结构上透镜的数目比消色差物镜多，比复消色差物镜少，成象质量上，远较消色差物镜为好，接近于复消色差物镜。d. 平视场物镜（Plan objective ）平场物镜是在物镜的透镜系统中增加一快半月形的厚透镜，以达到校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。平场物镜的视场平坦，更适用于镜检和显微照相。对于平视场消色差物镜，其倍率色差不大，不必用特殊目镜补偿。而平视场复消色差物镜，则必须用目镜来补偿它的倍率色差。