如何将mRNA序列变为现实v1.0

《如何将mRNA序列变为现实v1.0》由会员分享，可在线阅读，更多相关《如何将mRNA序列变为现实v1.0（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、成功将成功将 nn RNA 生产过渡到生产过渡到 CGMP 需要参与早期工艺需要参与早期工艺开发，使生产高效且有成开发，使生产高效且有成本效益本效益信使 RNAS（mRNAs）最广为人知的是作为 COVID-19 疫苗中的活性成分1。然而，mRNA 的临床潜力 也被积极应用，例如蛋白质替代、肿瘤学、自身免疫性疾病、细胞和基因治疗等，目前有335 项正在进 行的临床研究2涉及 mRNA。将 mRNA生物治疗药物成功推向临床并随后实现商业化，需要开发适当的上游和下游工艺，才能生产高 性价比而且符合所需关键质量属性（CQA）的mRNA，如何将如何将 序列变序列变为现实：为现实：通过参与早期工艺开通过

2、参与早期工艺开发，发，助力生产工艺降本增效助力生产工艺降本增效由于适合生产的可用技术数量有限，因此按照 CGMP 标准品生产 mRNA 具有挑战性3，并且需要仔细考 虑和协调多项任务以构建功能性端到端解决方案。图 1 显示了不同活动的复杂性，这些活动必须相互关联 才能确保稳健且成功的 CGMp mRNA 生产活动。1如何将mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图 2：从早期开发到 CGMP 生产的历程。定义早期开发所需的关键工艺步骤，以确保顺利过渡到CGMP。对第 2 步 和第 3 步的稳健评估最终关联到整个工艺流程的终点，而这个终点定义了 CGMP 活动成功与否。您

3、可以通过本白皮书了解您可以通过本白皮书了解到到在本文中，我们将讨论如果想要提供高质量 mRNA，为什么早期工艺优化是开发高效、具有成本效益的 CGMP 生产工艺的关键。我们将通过案例研究提供见解，说明实验设计（DOE）方法如何结合经验来优 化上游，通过提高产量，同时减少副产物和杂质，从而简化下游。我们还将通过一个案例研究来详细说 明-如何使下游过程适应性强且灵活。最后，我们将说明在早期工艺阶段与 Lon za 合作如何帮助开发可 放大、稳健且经济可行的 CGMP 生产活动。nn RNA 工艺步工艺步骤骤-所有步骤都具有可放大性且与所有步骤都具有可放大性且与 CGMP 兼容？兼容？IVT-nnR

4、NA加帽加帽在将mRNA生产过程从研发转移到更大规模之前，定义目标产品质量概况非常重要，然后确保每个单元操 作都满足此类产品特征。该策略将有助于开发平台化工艺，其中操作单元可以组合或交换，同时具有可 放大性和 CGMP 兼容性。将 mRNA生产过程转移到 CGMP 生产时，确定加帽策略是最重要的决策之一。目前，主要选择有两种：图 1：确保 mRNA CGMP 生产活动成功所需的相互关联的活动和能力。通常，需要采取几个步骤才能成功地将 mRNA分子带入 CGMP 生产活动（见图 2）。详细的工作流程从 模板设计开始，然后是 mRNA 的体外转录（IVT）和下游纯化步骤。下一阶段涉及工艺开发和放大

5、，这 些决策将在 CGMP 规模生产时产生重大影响和连锁反应。Lon za在mRNA生产方面拥有丰富专业知识，在 这里就可以考虑与Lon za这种合作伙伴进行合作，因为无论是原液（DS）还是制剂（DP）4J5都可以帮助 降低项目风险，并增加成功实现CGMP生产的机会。2如何将mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图 3：早期工艺开发决策及其对下游活动的影响。加帽策略是一个关键的例子，说明早期决策如何影响上游和下游 工艺步骤的定义，在质量、产量和生产成本之间取得平衡。CGMP生产的上游注意事项生产的上游注意事项稳健的上游工艺包括可放大的IVT反应，需要对化学反应空间进行

6、了详尽的表征，才能有效控制其中关键 参数。这种方法将允许完整定义工艺的范围和限制。优化反应参数，包括酶动力学，将减少副产物和杂 质的形成，并可以降低下游的复杂性。对IVT工艺的深入了解将有助于最大限度地提高产量、质量和生产 成本之间的平衡。这将通过充分了解关键工艺参数（CPP）来减轻和降低风险。案例研究案例研究案例案例1:优化优化 IVT 条件条件本研究的主要目标是开发一种以质粒DNA（PDNA）为模板的平台mRNA IVT工艺。为了确定最佳的IVT条 件，我们进行了实验设计（DOE）筛选，并辅以从内部专业知识中得出的一些条件，从而形成了一个有 50多种不同IVT条件组成的筛选组合。对获得的数

7、据进行分析，并将其与标准的起始IVT条件进行比较。我们的结果（图4）表明，某些条件导致mRNA产量增加了两到三倍。在随后的研究中，我们定义了一个 更小的化学空间（只有 20 个条件），足以确定测试mRNA最合适的 IVT 条件，从而显着减少工作量，并 且仍然使我们能够实现我们的目标，即开发一种可放大的、稳健的工艺，该工艺可与各种 mRNA 大小和 DNA 来源（细菌产生的 PDNA 或化学合成 DNA）的 DNA 模板一起使用。1.共转录2.转录后（酶）加帽这两种方案都提供了mRNA5末端的有效加帽，但不同方案将对产量、IVT反应期间转录产物的稳定性以 及下游工艺的设计产生影响 mm 图3概述

8、了加帽策略对mRNA整体生产的影响。因此，重要的是从一开始就 确定最终 DS 的产量、工艺速度和质量之间所需的平衡，然后选择最适合此类策略的原材料和工艺步骤。3如何将mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图4：IVT反应条件优化。在使用 DOE和内部知识定义的 50 多种不同的 IVT 条件下评估了 mRNA产量的提高（screening1 和 2）。与未优化的起始反应相比，平台筛选策略可以识别出更有希望的IVT条件。mRNA产量显示 为与起始条件相比的倍数变化（红色基线=1）。案例案例2：模板的序列和大小对：模板的序列和大小对IVT性能的影响性能的影响为了确定模板的

9、序列和大小对 nRNA 产量的影响，我们使用优化后的 IVT 条件（在案例 1 中确定）来生 产大 nRNA 分子（大）和标准 nRNA 分子（小）。我们比较了两种工艺的mRNA产量，结果（图5）表 明，与直觉相反，经过序列优化的较大mRNA分子比较小的mRNA分子获得更高的产量。这表明，无论使 用的nRNA分子大小如何，优化序列都可以提高产量。此外，这意味着除了序列优化外，即使对于小的 mRNA 模板，也应进行筛选以找到最佳 IVT 条件。正如本研究所示，较小mRNA的产量有可能提高至少 30%，这将对产量产生重大影响，并最大限度地降低CGMP工艺的产品成本。图 5：基于 mRNA大小和组成

10、来优化 IVT 反应的不同性能。在不同时间点（X 轴上1-mm9）测量 mRNA 总毫克数（Y 轴），时间点 9 为反应终点。小模板（mRNA1，浅蓝线），大模板（mRNA2，深蓝线）。案例案例 3：使用：使用 db DNA 优优化化 IVT 条件条件Doggy bone DNA（db DNA）可用作 PDNA 的替代品，用作 IVT 的 DNA 模板。在这项研究中，目标是优 化我们的平台mRNA IVT工艺，以便与db DNA一起使用。我们使用两种不同起始浓度的db DNA（40 ng/L和50 ng/L）和22种优化后的IVT条件（在研究1中确 定）。我们评估了筛选的 mRNA产量，结果（

11、图 6）表明，使用较低浓度的起始模板 db DNA（40 ng/L）获得了更高浓度的 mRNA（6.0 mg/mL+/mm 0.3）。而较高浓度起始模板 db DNA（5ong/L）获得4如何将mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图 6：使用 db DNA 作为 DNA 模板优化 IVT 反应条件。Lon za IVT 筛选平台已用于评估最合适的 IVT 条件，并结合 对不同浓度 DNA 模板的评估。评估mRNA IVT关键原材料通过体外转录生产nRNA需要一系列关键原材料。原材料供应商的选择：核苷酸、加帽试剂和酶，会影响 IVT工艺产量、杂质分布以及下游工艺规模和

12、成本。我们定期评估不同的原材料供应商，并根据质量、价 格、所需数量、供应链安全和 CGMP 合规性等标准评估他们的产品。案例案例 4：T7 聚合酶在聚合酶在 IVT 中的性能中的性能在这项研究中，我们对来自三个不同供应商的 T7 聚合酶进行了产量可比性评估。虽然针对供应商 1 优化 了 IVT 条件，但我们的结果（图 7）表明，供应商 3 的 T7 聚合酶的产量几乎是供应商 1 的 T7 聚合酶的两 倍，这表明单一 IVT 原材料可以推动工艺产量的重大变化。然而，优化产量需要与原材料成本、mRNA质 量相平衡，并且随着工艺转移到CGMP，还需要审查质量合规性方面。的mRNA浓度为5.5mg/m

13、L+/-0.2。这些结果表明，我们可以调整我们的IVT筛选方法，并将其与不同的 DNA模板（PDNA和db DNA）一起使用。该筛选平台与DNA性质和/或来源无关，可用于评估IVT反应的最 佳起始DNA浓度。5如何将mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图 7：同一 IVT 基质中 T7 聚合酶性能的比较。假设 T7 酶是唯一的反应变量（由三个不同的供应商提供），则对 IVT 反应进行了定量评估（mRNA产量）。考虑到使用供应商 1 的 T7 酶作为基线（=1）时获得的产量，产量差异 表示为倍数变化。CGMP生产的下游注意事项在下游工艺中，每个mRNA的内在理化特性决

14、定了最佳策略的选择。下游工艺应进行优化，以最少的步骤 缩短工艺持续时间，以保证nRNA质量并最大限度地减少材料损失，从而降低原材料成本。应简化从工艺 开发到 CGMP 生产的设备（如果需要）的可放大性和可清洁性，并选择能够从早期开发阶段生成关键工 艺参数的工艺开发设备，从而提高工艺产量。如上所述，产生更高的产量可以降低原材料成本，并缩短工艺开发时间，从而缩短项目时间。然而，在 工艺开发过程中收集的数据量和数据质量必须足以定义关键工艺参数（CPP）并支持设计空间定义，从 而提高工艺稳健性并确保预测性工艺建模。与上游工艺一样，实现这些优化目标将减少和降低规模放大 和转移到CGMP期间的风险。案例案

15、例 5：切向流过滤：切向流过滤研究研究该研究的目的是确定最佳切向流过滤条件，能够最大限度地提高 mRNA产物回收率，同时最大限度地减 少工艺时间和成本。我们评估了四种不同的切向流进样条件（见表1）。我们把之前层析纯化的固定浓度 mRNA加入到样品中（小mRNA和大mRNA）。然后，我们比较了所有四种切向流条件，结果（图8）显 示，随着切向流进样速率（L/min/m2）的增加，通量速率（LMH）也增加。更重要的是，我们在所有进 样速率下都测得了高mRNA回收率（80%），表明我们的切向流方法可以成功运行，并且不受进样速率 和mRNA大小的影响，可以用作纯化一系列mRNA构建体的平台方法。6如何将

16、mRNA序列变为现实：通过参与早期工艺开发，助力生产工艺降本增效图 8：切向流过滤参数评估作为平台纯化方法开发一部分。对大小和核苷酸组成方面高度不同的 mRNA评估不同 切向流过滤进样条件，示例显示 mRNA1：小（浅蓝色）和 mRNA2：大（深蓝色）。可变参数会根据评估的补料 条件而变化，但总体而言，不同的mRNA分子在测试条件下表现出相似的行为，这支持了平台方法建立的潜力。结论结论即使擅长运营最先进CGMP设施的生物制药公司，在向CGMp mRNA生产过渡时，通常也会低估构建端 到端工作流程所需的任务数量。为了在创新和制造之间架起一座桥梁，应要求开发团队或CDMO回答有 关早期开发问题，例如IVT筛选工艺的稳健性如何？该工艺在多大程度上针对 mRNA构建体的差异进行了 优化？在下游，要问的主要问题应该是关于如何设计下游工艺。哪些以及有多少个操作单元？一些具体 问题，例如超滤/渗滤（UF/DF）将评估多少工艺参数？需要添加哪些层析步骤？所选单位是否能够提供 所需质量的mRNA？早期决策还将影响工艺设备的尺寸，并确定CGMP设施是否适合用途。优化IVT条件、评估不同原材料并 考虑下游工