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1、第五章 烟草含氮化合物测定第一节 烟叶中氮化合物的特性及其测定意义1烟草中氮素形态：蛋白质 氨基酸 酰胺 NH3 硝酸盐 植物碱 未知氮化物2烟草氮化合物分类：1) 水不溶性氮：部分蛋白质（醇溶性和脂溶性蛋白质）2) 水溶性氮：除去不溶性蛋白质，剩余氮化物都是水溶性的，其中也包括了水溶性蛋白质。蛋白质占整个含氮化合物的60-90，植物体中蛋白质的含氮量为15-17.6，平均为16（蛋白质系数）烟草样品（干烟叶）中主要的含氮化合物是蛋白质（8%）和生物碱（1.5-3.5），其次是游离氨基酸（0.8）等。3含氮化合物测定意义1） 含氮量高的鲜烟叶，其多酚氧化酶活性也高，烘烤时易出现黑糟烟2） 含氮
2、化合物高的干烟叶，燃吸时，味苦，辛辣，刺激性强，杂气大。第二节、 烟叶总氮测定烟叶中总氮含量高，则其它氮化物含量往往也高，蛋白质和烟碱也高，因此测定总氮的含量对了解烟叶氮化物的特征具有代表性。一、测定方法测定主要有凯氏法和杜马法两种。杜马法就是将烟叶燃烧，收集N2和其它氮的氧化物，所用仪器十分精密。现在主要用的是凯氏法。二、凯氏法定氮1原理：烟草中的含氮化合物用浓硫酸消煮分解，使其中各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结合形成硫酸铵，然后加碱（NaOH）蒸馏，使硫酸铵中的NH3释放出来，用硼酸吸收，然后用标准酸（H2SO4）滴定，计算出N含量。1） 烟样消化 在高温下浓硫酸是一种强氧化剂，能将
3、有机物中的碳全部分解氧化成CO2,从而破坏了有机物的结构，样品中的含氮化合物，如蛋白质，在浓硫酸的作用下，水解为氨基酸，氨基酸脱氨产生NH3,NH3与硫酸结合成为硫酸铵留在溶液中。2）蒸馏 向消化液中加入过量的强碱NaOH，使（NH4）2SO4的NH3逸出，并用硼酸溶液吸收之。3)滴定 用标准酸滴定硼酸吸收的氨，根据标准酸的用量计算出消化液中的N量。这种测定总氮的方法最初是由凯德尔（Kjeldahl）1884年在研究蛋白质中的N时发明的，所以叫凯氏定氮法。该种方法测定结果准确可靠，但是（1）消化时间过长，浓硫酸（沸点360）在360下加热分解烟样需5h以上。（2）标准液配制麻烦。原始的凯氏定氮
4、法中，需要配制两种标准溶液（H2SO4和NaOH）。因为最初是用H2SO4吸收蒸馏出来的NH3,然后用NaOH滴定多余的H2SO4。2凯氏法的改进1） 缩短消化时间A 加入增温剂K2SO4或Na2SO4 K2SO4可以提高消化液的沸点，加速有机物质分解。K2SO4可以将消化液的沸点升高到400以上，但是一般应控制在360-400之间，如果加入K2SO4量过多，则会使沸点温度超过400，使生成的硫酸铵也会被分解释放出氨。一般每毫升硫酸加入0.5K2SO4即可。Na2SO4的作用与K2SO4相同，但效果稍差。 B 加入催化剂CuSO4 起催化作用的试剂还有有Hg HgO Se FeSO4 NiSO
5、4 从催化效率看硒汞铜，但是汞和硒都有毒，不常使用。CuSO4是目前广泛使用的催化剂。催化剂和增温剂混合同时使用效果更好，CuSO4 ：K2SO41：10 C 加入氧化剂 H2O2 HClO4 K2CrO7 氧化剂主要是提高消化液中的氧气，使供氧充足，大大缩短了消化时间。HClO4和 K2CrO7作氧化剂，可以将消化时间缩短到30-60min，但是K2CrO7会引入K离子，不能一液多用测定烟样中的K含量。HClO4不稳定。2） 蒸馏方法改进 a改全部蒸馏为部分蒸馏b承接流出液由硫酸改为硼酸NH3和硼酸没有起化学反应，而是吸附在硼酸分子上。3） 滴定方法改进由用标准NaOH滴定H2SO4,改为用
6、H2SO4滴定硼酸吸附的NH3。4） 消化工具改进改进前：凯氏瓶 电炉改进后：消化管 红外线消煮炉每批可以作40个样品。改进后形成了许多不同的方法，主要以消化时所加的试剂不同命名：1. H2SO4H2O2法 稳定，N不损失，2-3h2. H2SO4K2SO4法 稳定，时间长，不可测K3. H2SO4K2SO4CuSO4法稳定，时间长，不可测K4. H2SO4HClO4法 时间短，不稳定，N易损失5. H2SO4K2CrO4法 时间短不稳定N易损失 不测K三、H2SO4H2O2消化法测烟草总氮1原理 用强氧化剂高温消煮烟草样品，将其中的有机物质氧化成CO2,各种形态的氮素全部转化为氨，并与硫酸结
7、合形成硫酸铵，然后用碱（NaOH）蒸馏，使硫酸铵中的NH3释放出来，并用硼酸吸收，最后用标准酸（H2SO4）滴定硼酸吸附的NH3，并计算出样品N含量。2步骤1） 消化 0.2g样品于消化管中，加6mL浓硫酸，放置过夜（也可直接消化）于消煮炉上先低温慢加热至开始冒出大量白烟，待白烟减少时，取出稍冷却，逐滴加入30H2O2 10D，充分振荡继续放于消煮炉上加热，再冒白烟，再沸腾，待白烟再减少时，取出稍冷却，逐滴加入30H2O2 8D 充分振荡再继续消煮，每次待白烟减少时滴加的H2O2量都比前次减少2D，直至最后溶液澄清无色。最后一次滴加H2O2后应继续加热沸腾5-10min，以除尽H2O2。在消煮
8、的同时作2份空白试验：可以用葡萄糖代替烟样，也可以不用葡萄糖，直接将6mL浓硫酸进行消化。消化液冷却，加水稀释后定容100mL消化液颜色变化：黑色酱油色红宗色黄色无色2） 蒸馏从100mL待测液中取10mL于半微量凯氏定氮整流器中，加5mL40NaOH溶液蒸馏。流出液用加有2D溴钾酚绿甲基红指示剂的2硼酸5mL吸收。指示剂颜色变化：红紫色兰紫色3） 滴定用已知浓度的标准酸0.01mol/LH2SO4滴定流出液中被硼酸吸附的NH3, 溶液颜色变化：兰紫色微红色，根据标准酸的用量计算出烟叶总氮含量。四、扩散皿法测烟叶总氮1原理同消煮法2待测液制备同消煮法3用扩散法代替蒸馏法将待测液中硫酸铵中的NH
9、3扩散进入硼酸溶液中，然后用标准酸滴定硼酸溶液中吸附的NH3。扩散皿的内室（低）装入2mL硼酸溶液，外室（高）加入1mL待测液盖上毛玻璃，边缘涂上碱性甘油密封后，从小空向外室注入1mL 40NaOH溶液，立即密封。在25-30扩散24h。扩散温度不易超过30，否则扩散皿会破裂。第三节、烟草中蛋白质测定一、间接法 ：通过测定样品中蛋白质的含氮量来推算蛋白质的含量的方法。1间接计算法粗蛋白质（总N%-烟碱*0.1728）*6.252间接测定法1) 原理：先把蛋白质从烟样中分离出来，然后对含蛋白质的沉淀进行消化，蒸馏和滴定，测出蛋白质中总氮含量，然后根据蛋白质系数6.25换算出蛋白质含量。2)步骤2
10、g样品于烧杯中，加入50mL沸水，6CuSO4 和NaOH各25mL加热搅拌15min，放置1h过滤，蛋白质形成的沉淀留在残渣中，虑液中是水溶性氮化物。这就将蛋白质和水溶性氮化物分开了取下带虑渣的漏斗60稍烘干滤纸带残渣一并放入消煮管内消化，蒸馏，滴定，测定出蛋白质含氮量，并计算出蛋白质的量。蛋白质蛋白质N%*6.25二、直接法：根据蛋白质的理化性质如，对紫外光的吸收，双缩尿反应等测定蛋白质的含量。鲜组织中蛋白质的测定最常用的是考马斯亮蓝法，该法用牛血清蛋白作工作曲线牛血清蛋白需在低温冰箱中保存。第四节 水溶性总氮的测定烟叶总的氮化物包括：1可溶性氮2不可溶性氮间接测定法测定蛋白质时，将烟叶总
11、的氮化物分为两部分：1蛋白质2除去蛋白质外的水溶性氮化物水溶性总氮包括:氨态氮，酰胺态氮，氨基态氮因此将除去蛋白质的水溶液消化后,按照凯氏法测定其中的氮含量,就是水溶性总氮.（一）酰胺态氮的测定1、原理：酰胺化合物在酸性或碱性条件下都易于分解产生NH3用3M硫酸加热水解水溶性氮液，使酰胺全部水解产生硫酸铵，用NaOH中和硫酸，再以缓冲溶液（硼砂+ NaOH ）在低温低压条件下蒸馏，使酰胺分解产生的NH3逸出，自由态NH3也逸出，其他形式的N化合物不被分解，这样蒸馏出来的NH3包括了酰胺氮和自由氨所含的氮。从中减去自由氨中的氮，即为酰胺氮（二）自由态氮的测定原理：自由态氮易挥发，如果在强碱介质中蒸馏，其他形式的氮也被蒸馏出来，因此在缓冲溶液中并且低温低压条件下，直接蒸馏水溶性氮待测液，测出的就是自由氨中的氮。与酰胺氮测定的区别：免去3M硫酸水解，及加NaOH中和（三）总植物碱氮的测定烟草中主要的植物碱：烟碱，降烟碱，新烟草碱，假木贼碱总植物碱氮近似烟碱0.1728（四）未知来源的氮测定烟草可溶性氮化合物包括：自由氨，酰胺，烟碱，胺和其他形式未知态氮化合物。用强碱蒸馏可溶性氮液，可以将各种形式的氮化合物都蒸馏出来，除植物碱外，都是以NH3-N的形式被承接（盐酸）吸收的。以铵盐存在。铵盐可以和纳氏试剂显色，在一定范围内颜色深浅和铵盐量成正比。未知N比色测得N%-自由态氨N%-酰胺态N%
