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1、细胞培养学笔记（4）一、细胞一般形态学观察法1.细胞固定方法:(1)甲醇/醋酸(3:1):甲醇穿透力好易于挥发;醋酸固定蛋白效果好,可使细胞膨胀,结合使用,能维持细胞形态不变,用于观察染色体.(2)FAA固定液:(80%酒精90ml;冰醋酸5m1;中性福尔马林(用时向瓶中加过量MgCO3中和)5ml.) 用于盖片单层培养. (3)Carnoy(纯酒精60 ml;氯仿30ml;冰醋酸10ml):是非水溶性固定液, 穿透力差,适用于显示细胞化学成分等方法,对固定培养单层细胞效果非常好.2.一般染色法:Giemsa染色法: (1)Giemsa粉0.5g,甘油22ml研磨;(2)56保温2小时后,加入
2、33ml纯甲醉,保存; (3)pH6.8-7.38的磷酸盐缓冲液,按1:9比例稀释染液;(4)甲醇固定10min,或醋酸/甲醇固定30min, 染色;(5)染10-15min,自来水冲,干燥,二甲苯透化,树脂胶封.胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色.苏木精-伊红染色法:(1)37温BSS洗3次,20s-1min,中性福尔马林固定3min;(2)蒸馏水洗1次,再用稀释的苏木精液(1/20)染10min;(3)水洗,置入1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色;(4)伊红水溶液中染30s-1min;(5)蒸馏水洗,迅速通过丙酮2次,每次3-5min;(6)通过2:1丙酮/二甲苯3次,每次1-2min;
3、(7)通过1:2丙酮/二甲苯3次.每次1-2min;(8)纯二甲苯5-10min;(9)把盖片置载物玻片上,用树胶封存,再覆以较大盖片.Feulgen染色法:鉴别细胞中DNA的组织化学方法.细胞中的DNA在60,用1M HC1酸解离脱氧核糖核酸,使嘌呤碱基与糖苷键破坏,嘌呤碱脱掉,脱氧核糖中的醛基游离;醛基能与Schiff试剂相结合,形成一种紫色的复合物.(1)单层盖片法培养细胞,Carnoy或醋酸/甲醇固定20-30min; (2) 室温投入1M HC1 1-2min(3) 60投入1M HCl 8-10min;(4) 10暗处投入Schiff剂中染色1-5h;(5)漂洗液洗2x2min;(
4、6)蒸馏水漂洗2x2min;(7) 酒精75%-100%脱水;(8)透化:二甲苯2次,每次3min;(9)盖片置于载物片上,滴少许树胶,再加较大盖片覆盖;(10)盖片加微型重物加压数日,树胶干后观察.镜下可见,细胞核成粉红色至紫红色,胞质无色.吖啶橙染色荧光观察法:(1)盖片培养细胞,温Hanks洗3-5s;(2)投入95%酒精或醋酸/甲醇min;(3)1%醋酸作用30s;(4)110-4吖啶橙染30s或1min; (5) 0.1MCaCl2处理30s -2min;(6)PBS漂洗3次,每次数秒; (7)PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照.3.透射电子显微镜:常用超薄切片法、冷冻超薄切片法
5、、冷冻复型法超薄切片法:取材;固定(戊二醛2.5%-5%;锇酸1%;高锰酸钾;甲醛、多聚甲醛);脱水二、免疫细胞化学技术观察细胞成分法1.原理:用荧光素或酶等标记物或显色物标记特异性抗体,通过免疫学反应与细胞内的相应抗原结合,形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合物.可用荧光显微镜或普通光学显微镜观察到复合物,达到检测细胞内抗原物质的目的.细胞免疫化学包括标本的准备(制备、储存、固定)、染色方法以及结果的分析判断,非特异性染色的减轻、消除等.2.标本制备及固定:细胞可直接培养在盖玻片上、培养瓶内或培养板上,也可将一定量的细胞收集离心制成涂片.福尔马林类1-15 min;丙酮类5-15min; 4
6、%多聚甲醛类3-5min注意事项:立即固定,防止细胞自溶,保持其固有的组织结构,保存细胞内的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散和保证免疫组化定位准确.彻底清洗多余的固定液,否则将影响免疫组化染色效果.以室温为宜,某些酶的固定,要求在37下进行.3.染色方法(1)免疫荧光技术:直接法:以荧光素标记的抗体直接与标本内的抗原反应,形成抗原-荧光素标记抗体复合物.(1)固定, PBS洗33min;(2)荧光素标记的抗体,湿盒内37孵育50min, PBS洗;(3)0.1%伊文氏兰复染,PBS洗33min,去NaCl结晶;(4)甘油封片,镜检.间接法:特异性抗体与细胞内相应抗原结合,再用荧光素标记的二抗与
7、特异性抗体相结合,形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物.(1)固定,PBS洗涤33min; (2)滴加一抗,37 40min或4过夜, PBS洗33min; (3)滴加荧光标记二抗3740min PBS洗33min;(4)0.1%伊文氏兰复染; PBS洗33min;(5)甘油封片,镜检.(2)标本保存及封片介质的制备:如需保存,可在0-5暗处保存.用缓冲甘油封固的标本,过夜后特异荧光褪色约25%,一周后褪色约60%,用聚乙烯醇封片,保存的时间长一些.但罗丹明在中聚乙烯醇溶解,故用罗丹明标记抗体的染色标本,不宜用聚乙烯醇封片.缓冲甘油液(pH 8.5)的制备:0.5MpH8.5碳酸盐缓冲液
8、1份,无荧光甘油(AR)9份混合后充分搅匀即可.聚乙烯醇-缓冲甘油混合剂的配制:0.5M pH8.5碳酸盐缓冲液4份,聚乙烯醇1份,混合搅匀(约需6小时)后,再加入1份AR,继续搅拌6h,离心72000转/分,60分钟,去上清液分装在棕色瓶内,4保存备用.(4)免疫酶标技术免疫酶标法和免疫荧光法比较:用普通的光学显微镜即可检测,易于推广;对比度好,且染色后可长期保存;可用苏木精等试剂复染,可将免疫组化染色结果与形态学特征相结合进行分析.不仅可用光镜观察,而且能用于超微结构的研究.直接法原理:先将酶与抗体结合形成酶标抗体,然后和相应的抗原反应,使抗原抗体复合物上带有酶分子,再与酶的底物H2O2-
9、 DAB(33-二胺荃联苯胺)发生显色反应,在显微镜下观察,根据颜色产物检测相应抗原.间接法是将酶标记在第二抗体上,再与已形成的抗原抗体复合物中的第一抗体反应.目前广泛应用的PAP法、ABC法是在间接法的原理和技术的基础上发展起来的.直接法:(1)标本固定,PBS洗涤23min; (2)1% H2O2(1%H2O2甲醇)抑制内源性过氧化物酶,室温10-20min; (3)正常血清(1:10)孵育,室温20min;(4)滴加酶标记的抗体371h或4过夜,PBS洗23min;(5)DAB+H2O2显色5-10min,镜下控制染色结果;(6)充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检.目前只用于单克隆
10、抗体的筛选及酶联免疫吸附试验.间接法:(1)-(3)同直接法;(4)滴加第一抗体,37 1h或4过夜,PBS洗涤33min; (5)滴加酶标二抗,室温1h,PBS洗涤33min; (6)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min;(7)充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检.PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法)PAP的基本原理是在间接法的基础上,即在加完酶标二抗以后,再加一个PAP复合物(过氧化物酶-抗过氧化物酶抗体复合物)PAP复合物为由3个酶分子和2个抗酶抗体亚单位构成的复环形复合物,其稳定性很强,冲洗时不会脱落.在这种方法中,PAP复合物中的抗酶抗体与特异性一抗必须
11、来自同一种属动物.其优点是比间接法更为灵敏,而且背景染色低.1)-(3)同直接法;(4)滴加一抗,室温1h或4过夜, PBS洗33min; (5)滴加二抗,室温30min,PBS洗33min; (6)加PAP复合物,室温60min,PBS洗33 min;(7)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min; (8)充分水洗,苏木精复染,封片观察.双PAP法:这种方法可在复合物体系中连接更多的PAP复合物,对抗原可进一步放大,因此灵敏度更为增强,适用于微量抗原的检测.(1)-(6)同单PAP法;(7)二次加二抗,PBS洗;(8)二次加PAP, PBS洗;(9)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min; (10)苏木素复染核,封片,镜检.ABC法(卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法):由于卵白素与生物素具有高度亲和力,可形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物),ABC复合物与生物素化二抗结合,最后形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC复合物.(1)-(5)同PAP法;(6)加ABC液(A与B液等量,于用前30min混合),室温60min,PBS洗;(7) 0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min;(8)充分水洗;苏木精复染、封片、镜检.
