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1、无菌工艺验证指引原则1 概述无菌药物是指法定药物原则中列有无菌检查项目制剂和原料药，普通涉及注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。从严格意义上讲，无菌药物应完全不具有任何活微生物，但由于当前检查手段局限性，绝对无菌概念不能合用于对整批产品无菌性评价，因而当前所使用“无菌”概念，是概率意义上“无菌”。一批药物无菌特性只能通过该批药物中活微生物存在概率低至某个可接受水平，即无菌保证水平（SterilityAssuranceLevel,SAL）来表征。而这种概率意义上无菌保证取决于合理且通过验证灭菌工艺过程、良好无菌保证体系以及生产过程中严格GMP管理。无菌药物普通灭菌方式可分为：1）湿热灭菌；2）干热灭菌
2、；3）辐射灭菌；4）气体灭菌；5）除菌过滤。按工艺不同分为最后灭菌工艺（sterilizingprocess）和无菌生产工艺（asepticprocessing）。其中最后灭菌工艺系指将完毕最后密封产品进行恰当灭菌工艺，由此生产无菌制剂称为最后灭菌无菌药物，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药物办法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工艺。某些或所有工序采用无菌生产工艺药物称为非最后灭菌无菌药物。基于无菌药物灭菌/除菌生产工艺现状，本指引原则重要对在注射剂与无菌原料药生产中比较惯用湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。本指引原则中湿热灭菌工艺验证重
3、要涉及灭菌条件筛选和研究，湿热灭菌物理确认，生物批示剂确认等内容；无菌生产工艺验证重要涉及无菌分装、除菌过滤、培养基模仿灌装、过滤系统验证等验证内容。最后灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌办法有本质上差别，从而决定了由这两类工艺生产产品应当达到最低无菌保证水平巨大差别。最后灭菌无菌产品无菌保证水平为残存微生物污染概率10-6，非最后灭菌无菌产品无菌保证水平至少应达到95%置信限下污染概率0.1%。由此可见，非最后灭菌无菌产品存在微生物污染概率远远高于最后灭菌无菌产品，为尽量减少非最后灭菌无菌产品污染微生物概率，勉励公司在生产中采用隔离舱等先进技术设备。基于质量源于设计药物研发与质量控制理念，为
4、保证无菌药物无菌保证水平符合规定，研发者在产品研发过程中应依照药物特性选取适当灭菌方式，并系统地评估生产各环节及各种因素对无菌保证水平影响，依照风险高低与风险发生也许性等来针对性地验证灭菌工艺可靠性，验证内容、范畴与批数等取决于工艺与产品复杂性以及生产公司对类似工艺经验多少等因素。只有在研发中通过系统而进一步研究与验证，获得可靠灭菌工艺，并在寻常生产过程中严格执行该工艺，才干真正保证每批药物无菌保证水平符合预期规定。固然，在药物整个生命周期内，随着对所生产药物特性和生产工艺等理解越来越全面和进一步，灭菌工艺也在不断完善，此时就会涉及到对变更后工艺如何进行验证问题，本指引原则也合用于此种状况。由
5、于灭菌/除菌工艺验证工作在国内开展时间不长，基本还不牢固，因而必然在实际工作中会遇到诸多难以预料问题，故本指引原则只是一种普通性原则，药物研发者应从药物研发客观规律出发，详细问题详细分析，必要时依照实际状况采用其她有效办法和手段。同步，本指引原则作为阶段性产物，必将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证认知加深，而不断进行修订与完善。2制剂湿热灭菌工艺2.1湿热灭菌工艺研究2.1.1湿热灭菌工艺拟定根据灭菌工艺选取普通按照灭菌工艺决策树（详见附件1）进行，湿热灭菌工艺是决策树中一方面考虑灭菌工艺。湿热灭菌法是运用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物办
6、法。高温在杀灭微生物同步，也许对药物质量也有所影响。如果产品不能耐受湿热灭菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。因此，对于药物灭菌工艺考察和拟定，一方面是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌高温。当前湿热灭菌办法重要有两种：过度杀灭法（F012）和残存概率法（8F012）。用其他F0值不大于8终端灭菌条件工艺，则应当按照无菌生产工艺规定。以上两种湿热灭菌办法都可以在实际生产中使用，详细选取哪种灭菌办法，在很大限度上取决于被灭菌产品热稳定性。药物与否能耐受湿热灭菌工艺高温，除了与药物活性成分化学性质有关外，还与活性成分存在环境密切有关，因此在初期工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析
7、，以拟定能否采用湿热灭菌工艺。2.1.1.1活性成分化学构造特点与稳定性通过对活性成分化学构造进行分析，可以初步判断活性成分稳定性，如果活性成分构造中具有某些对热不稳定构造基团，则提示主成分热稳定性也许较差。在此基本之上，还应当通过设计一系列强制降解实验对活性成分稳定性做进一步研究确认，理解活性成分在各种条件下也许发生降解反映，以便在处方工艺研究中采用针对性办法，保障产品可以采用湿热灭菌工艺。2.1.1.2处方工艺研究在对活性成分构造特点与稳定性进行研究基本上，可以有针对性进行处方工艺优化研究。如活性成分易发生氧化反映，则需要考虑与否需要在工艺中去除氧并采用充氮生产工艺，或在处方中加入适当抗氧
8、剂；如活性成分稳定性与pH值有关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性pH值，固然此时需要关注该pH值在临床治疗时能否接受；如果主成分是由于某些杂质存在影响了稳定性，则需要通过适当手段去除有关杂质；如果是主成分在某种溶剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用溶剂系统在临床应用时能否被接受；湿热灭菌不同灭菌温度和灭菌时间组合对产品稳定性规定有所不同，可以在保证提供所需SAL基本上，通过灭菌时间和灭菌温度调节来拟定药物可以耐受湿热灭菌工艺。总之，需要通过各个方面研究，使药物尽量可以采用湿热灭菌工艺。只有在理论和实践均证明虽然采用了各种可行技术办法之后，活性成分依然无法耐受
9、湿热灭菌工艺时，才干选取无菌保证水平较低无菌生产工艺。2.2.1.3稳定性研究无论使用何种设计办法，都需要进行最后灭菌产品稳定性研究。考察最后灭菌程序对产品性质稳定性影响实验可涉及产品降解、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品其他质量特性。灭菌时，杀灭微生物效果和活性成分降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却变化将影响产品稳定性，同步影响杀灭效果。因而，稳定性研究用样品最佳选用处在最苛刻灭菌条件产品，如：可采用在热穿透实验中F0最大位置上灭菌产品进行稳定性考察，以保证灭菌产品质量仍能符合规定。2.1.2过度杀灭法工艺研究普通来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需被灭菌品开始生产阶段和寻
10、常监控阶段生物负荷信息较少，但是过度杀灭规定热能比较大，其后果是被灭菌品降解也许性增大。过度杀灭法目的是保证达到一定限度无菌保证水平，而不论被灭菌产品初始菌数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物耐热性都比较低，很少发现自然生成微生物D121值不不大于0.5分钟。因而，过度杀灭灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高无菌保证值。由于该办法已经对生物负荷及耐热性作了最坏假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品微生物污染。如果实际生产中
11、可以严格遵循GMP规定，这一点是可以实现。2.1.3残存概率法工艺研究与过度杀灭法相比，残存概率法办法所需信息量要大得多，涉及被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段信息、批示菌（对灭菌程序呈现强耐热性实验菌）以及生物负荷信息。只有积累了此类有价值信息后，才干制定比过度杀灭法F0值低热力灭菌程序，同步产品无菌保证水平不会减少。使用热力较低灭菌程序更有助于药物稳定性，使产品有效期延长。正是由于这个因素，残存概率法更适合那些处方耐热性较差最后灭菌产品。普通说来，不耐热药物灭菌也许不能使用过度杀灭法，需要设计一种灭菌程序可以恰本地杀灭生物负荷，同步不导致产品不可接受降解。这种状况下，灭菌程序确认就需研究产
12、品生物负荷和耐热性。依照如下公式可以比较清晰阐明这一点：无菌保证值=F0/D-lgN0其中，无菌保证值是SAL负对数，N0为灭菌开始时产品中污染微生物总数，D为污染微生物耐热参数。因此，菌工艺无菌保证值与F0、N0、D密切有关。2.1.3.1灭菌前生物负荷控制采用残存概率法进行终端灭菌产品，除了需要关注灭菌过程自身，还需要在生产过程中采用某些恰当手段来监测和控制药物灭菌前生物负荷。详细办法普通涉及灭菌前微生物数量与耐热性监测、药液过滤、工艺参数控制等等。灭菌前微生物污染水平监测将在下面章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌产品中仅仅作为辅助控制手段，但是在工艺拟定过程中，也应当对滤膜孔径、材质、滤器
13、使用周期进行必要筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物特性，普通在药液放置期间也会逐渐繁殖，特别某些营养型注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有助于微生物生长和繁殖，因而应通过工艺筛选和验证来拟定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前可以放置最长时限，并相应拟定产品批量、生产周期等核心工艺参数。2.1.3.2灭菌前微生物污染监测灭菌前微生物污染水平监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选用生产过程中污染最大，最有代表性样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前放置时间。普通而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下
14、办法：先用灭菌5%吐温充分湿润0.45um滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在3035下培养37天，计数。分离获得污染菌需要进行耐热性检查。污染菌耐热性检查可以采用如下测定办法：先用灭菌5%吐温充分润湿0.45um滤膜，然后过滤污染水平监测所取药液样品，再将此膜移至装有无菌待监测产品试管中，在沸水浴上煮沸约30分钟，然后在30-35下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观测与否有耐热菌生长。当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定期煮沸法将它和已知生物批示剂耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌D值（D值详细检测办法详见附件2），然后依照灭菌F0值及污染菌数量与耐热性对产品
15、无菌做出评价。当产品微生物污染水平超原则时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌来源并采用相应纠正办法。2.2湿热灭菌工艺验证湿热灭菌工艺验证普通分为物理验证和生物学验证两某些，物理验证涉及热分布、热穿透实验，生物学验证重要是微生物挑战实验。物理验证是证明灭菌效果间接方式，而微生物挑战实验则直接反映灭菌效果，两者不能互相代替。2.2.1物理确认2.2.1.1空载热分布实验空载热分布目是重要是理解整个灭菌设备运营状况，确认灭菌室内温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置温差状况，拟定也许存在冷点。空载热分布实验普通采用足够数量热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室不同位置。温度探头安放位置
16、需要依照设备类型和不同位置下灭菌风险评估而定，应涉及也许高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、接近温度记录探头处，其她探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度检测具备较好代表性。温度探头在实验先后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后，即可以按照设定灭菌程序进行灭菌。2.2.1.2装载热分布实验装载热分布实验目是理解设备在装载条件下内部温度分布状况，涉及高温点、低温点位置，为后续评估和验证打下基本。装载热分布普通在空载热分布基本上进行。温度探头个数和安放位置普通同空载热分布实验，注意一定要在空载热分布实验拟定冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌容器周边，注意不能介入待灭菌容器。装载热分布实验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量状况，进行实验时，应尽量使用待灭菌
