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1、结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究现状及展望【关键词】 分枝杆菌;结核；抗原；检测结核病的实验室诊断技术主要包括细菌学、免疫学和分子生物学等三大领域的诊断方法。与细菌学和分子生物学技术相比，免疫学诊断技术同时兼具简便、快速、价廉、无需贵重仪器、容易在基层实验室推广等优势，因此，长期以来一直是结核病研究人员重点关注并且坚持不懈努力的研究方向。结核病免疫学诊断分为两个类型：依据机体对病原菌结核分枝杆菌（MTB）诱发的免疫应答反应进行检测，又分为体液免疫检测和细胞免疫检测两个方面；针对病原菌 MTB 的特异性抗原进行检测。由于机体受到MTB感染后，体内首先出现的是结核分枝杆菌特异性抗原，并且结核抗原的
2、检测可以作为结核杆菌存在的直接证据，可以避免结核病患者由于免疫应答低下导致的体液免疫检测或细胞免疫检测的“假阴性”，因此检测结核分枝杆菌特异性抗原更有可能发展成为结核病早期、快速、敏感、特异，并且适宜在发展中国家推广应用的新型诊断方法，因而也越来越受到人们的重视。现就结核分枝杆菌特异性抗原检测的研究进展做一综述。1 结核分枝杆菌特异性抗原检测的技术方法1.1 凝集试验（Agglutination test）Krambovitis等1于1984年首次报道了胶乳凝集试验（LPT）在结核病诊断的中的应用。作者通过纯化兔抗结核分枝杆菌胞膜抗原免疫球蛋白致敏乳胶颗粒，检测脑脊液（CSF），观测凝集发生与
3、否诊断结核性脑膜炎。Cambiaso 等2通过将牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis） 抗体（Fab）2 连接乳胶颗粒，对组织液标本中的结核抗原进行检测，较大地提高了检测敏感性。Chandramuki 等3 应用反向间接血凝试验（RIHG）对结核性脑膜炎CSF中结核抗原检测进行了探索。1.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）Sada等4于1983年首次建立了双抗体夹心ELISA（s ELISA）检测CSF中结核抗原，取得了较为理想的的检测结果。其后国内外众多学者应用不同形式的 ELISA 方法对结核分枝杆菌特异性抗原检测进行了探索。与凝集试验相比，ELISA检测结果的敏感性和特异性
4、都有一定的提高。1.3 免疫斑点法(Dot immunobinding assay, DotIba)DotIba 是20世纪80年代中期发展起来的固相标记免疫测定技术。其技术原理接近ELISA方法，只是将抗原包被于固相的硝酸纤维素膜上，通过相应的抗体特异性吸附，洗涤，最后应用酶标二抗检测。与ELISA法相比，DotIba操作更为简单，所需试剂少，结果肉眼即可判读，检测结果还可常时间保存，不需特殊设备，易于普及和推广。Sumi 等5 于1999年应用Dot-Iba 技术对结核性脑膜炎患者CSF 中的结核杆菌抗原进行了研究报道。1.4 免疫金标技术(Immunogold labelling tec
5、hique) 该技术是20世纪80年代中后期发展的一种新型免疫学标记和检测技术，目前在医学检验中的应用主要是免疫金标层析法（Immunochromatography）和免疫金标渗滤法 (Dot-immuogold filtration assay，DIGFA)。免疫金标技术是在DotIba检测原理的基础上进一步发展，但应用胶体金标记替代了酶标记，利用金颗粒具有高电子密度的特性，当标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼即可见红色或粉红色斑点，因而可以用于定性或半定量检测。与ELISA和Dot-Iba技术相比，其操作更为简便、快速，可将常规ELISA检测所需的操作时间由24h缩短至515min，且检
6、测的敏感性和特异性保持不变。Stavri6于2003年首先应用DIGFA技术检测了结核病患者血清和痰液中的结核抗原。2 结核分枝杆菌特异性靶抗原的选择及特性2.1 菌体细胞通过将结核分枝杆菌减毒株H37Ra，或BCG株进行超声破碎，应用抽提物直接免疫动物，获得anti-H37Ra 或 anti-BCG血清，用以做为待检抗原的捕获抗体。Sada等4首先以ELISA双夹心法检测结核病患者CSF中的BCG抗原，在4例细菌学肯定的结核性脑膜炎，12例临床诊断而无细菌学证据者CSF中，BCG抗原阳性者各为4/4例及9/12例，11例对照组均检测阴性。检测的敏感性为81.25，特异性为95。Srivast
7、ava等7应用Dot-Iba 检测50例结核性脑膜炎患者与48例对照患者CSF中的 H37Rv抗原，其敏感性为90.0，特异性为95.8，比较了ELISA法检测CSF中抗H37Rv抗体（敏感性为74，特异性为89.6）和血清中结核杆菌抗H37Rv抗体（敏感性为50，特异性为91.67），结果显示结核抗原检测的敏感性与特异性均高于抗体检测。王宁山等8建立了Dot-Iba方法检测CSF中结核菌体抗原，15例结核性脑膜炎患者不同期42例CSF中38例检测阳性反应。1例患者于发病5d即发现抗原。随后，该作者又用PCR、Dot-Iba、ABCELISA法测结核性脑膜炎CSF中结核菌DNA、抗原、结核菌A
8、60抗体9。结果显示，PCR和抗原在早期可作为结核性脑膜炎诊断的重要手段，且结核性脑膜炎患者经抗痨治疗后，CSF中抗原量逐渐下降，直至消失，与治疗有效呈平行关系；特异性抗体检测早期阳性率低于抗原检测，但中晚期稍高，在结核性脑膜炎诊断时可作互补。2.2 PPD培养结核分枝杆菌减毒株H37Ra，去除菌体细胞收获培养物滤液蛋白，纯化而成PPD，继而免疫兔子，获得抗血清，其也可做为待检抗原的捕获抗体。Mathai等10 应用Dot-Iba技术检测了30例结核性脑膜炎患者与40例对照组患者CSF中的结核PPD抗原，显示检测敏感性为83.3%，特异性为95。2.3 LAM(Lipoarabinomanna
9、)抗原Hunter等11在获得LAM 后就证明该抗原存在 9 个单克隆抗体结合表位，它在病原体与宿主的相互作用中起着关键作用并深刻影响体液、细胞免疫的发生和发展。很多学者采用LAM抗原检测TB 病人抗体1214，先后证实该抗原检测TB 病人血清有较强的敏感性和特异性。既然大多数结核病患者血清中存在LAM抗体，Sada15推测也许患者血清中存在循环的LAM抗原。作者以LAM抗原免疫兔子，层析纯化到抗LAM血清，建立协同凝集检测技术，检测患者血清标本，结果菌阳活动性结核病检出率为88（44/50），菌阴结核病检出率为67（6/9），特异性为100（126/126）。此后较多的学者对体液中LAM抗原
10、进行追踪研究。特别使人意外的是近几年连续有报道在结核病患者尿液中查到LAM抗原，检测的敏感性为5090，特异性高达871001618。2.4 14 KDa 抗原14 KDa抗原是从MTB培养滤液中分离出来的蛋白抗原，Sumi于1999年应用14KDa 抗原免疫兔子，获得相应抗血清，应用Dot-Iba检测结核病患者CSF中循环抗原获得成功15，进一步与PCR技术同步检测结核病脑膜炎患者CSF，结果两者的特异性均为100（45/45），但免疫学检测14KDa 抗原的敏感性是75.7（28/37），高于PCR技术的检测敏感性（40.7, 15/37）19。2.5 31KDa 抗原31 KDa 抗原又
11、称为ES31，是在H37Ra培养滤液中分离出来的糖蛋白抗原，具结核分枝杆菌的丝氨酸蛋白酶活性。Bera 等20通过对31K Da 抗原免疫山羊，获得相应多克隆抗血清，应用 sELISA 检测结核病脑膜炎患者CSF和血清中的31 KDa 抗原，并同步应用间接ELISA检测CSF和血清中相应抗体，结果显示31 KDa 抗原检测的敏感性在CSF和血清中分别为90（18/20）、80（16/20）而CSF和血清中相应抗体的检出率分别是85（17/20）、80（16/20），研究结果表明检测结核病脑膜炎患者CSF和血清中的31 2.6 Hsp65 抗原 属于结核分枝杆菌热休克蛋白（hsp）家族，在结核菌
12、感染人体后，Hsp65会诱导宿主产生较强的体液和细胞免疫反应。Mudaliar 等21将待检CSF标本包被在微孔板上，应用Hsp65单克隆抗体特异进行捕获，通过酶联显色检测CSF中Hsp65 抗原，结果显示其检测敏感性为82.5%（66/80），特异性为90（72/80）。最近Rajan等22又进一步应用Hsp65单克隆抗体检测结核病患者血清标本中的Hsp65抗原，检测敏感性为82，特异性为89，显示了较好的应用前景。3 问题与展望尽管应用免疫学技术检测结核病抗原已有20多年的历史，在检测技术和研究思路都有较大的进展，但仍存在一些问题，主要表现为：是缺乏高效价的特异性抗体，目前国外虽在近几年已
13、有应用特异性结核抗原免疫动物，并纯化出高效抗体的研究报道，但基本上均属小样本量研究，缺少大标本量的临床评估；目前结核抗原检测的标本主要集中在脑脊液，对其它含有较高蛋白或细胞成分过多的临床标本，结核抗原的检测要困难的多，如痰、支气管灌洗液（BALF）、胸、腹水标本在进行结核抗原检测前必须经过适当处理；进入结核病患者体内的特异性结核循环抗原量较低，且在疾病的进展期又可能与相应的抗体在体内结合而形成循环免疫复合物(CIC)，因而使血清中抗原检测的敏感性尤其受到限制。目前重点关注的研究内容包括：着重于结核杆菌特异性抗原的结构分析和纯化技术，将分枝杆菌属内菌体抗原的交叉降低到最低限度，这是结核抗原检测中
14、进行靶特异性抗原选择的基础。国内外学者对此已做了大量工作2325，但仍有待深入继续研究。进一步发展单克隆抗体制备技术，取得高效价的特异性抗体对提高结核抗原检测的敏感性和特异性至关重要。加强结核分枝杆菌感染与机体免疫应答的机制研究，重视结核病细胞免疫与体液免疫之间的内在联系；研究结核抗原测定的影响因素以及与结核抗体测定的相互关系，并进而确定结核抗原测定时最佳取材的时机及临床意义。对测定方法的最佳测定条件，可能的影响因素等进行细致研究，特别注重蛋白质包被和标记技术的研究。对多种特异性靶抗原进行优化组合，进一步提高结核分枝杆菌特异性抗原检测的敏感性和特异性。【参考文献】 1Krambovitis E
15、, McIllmurray MB, Lock PE, et al. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by latex particle agglutinationJ. Lancet, 1984, ii (8414): 12291231.2Cambiaso CL, Van Vooren JP, Farber CM. Immunological detection of mycobacterial antigens in infected fluids, cells and tissues by latex agglutination. Animal model and clinical applicationJ. J Immunol Methods, 1990,129(1): 914.3Chandramuki A, Allen PR, Keen M,et al. Detection of mycobacterial antigen and antibodies in the cerebrospinal fluid of patients with tuberculous meningitisJ. J Med Microbiol, 1985, 20 (2): 239247.
