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1、泌尿系统肿瘤抑癌基因研究新进展抑癌基因的失活或癌基因的激活与肿瘤的发生、发展关系密切。抑癌基因的点突变、重组、缺失或甲基化所致的功能失活与多种人类恶性肿瘤的发生及发展有关。抑癌基因编码的蛋白质具有多种功能。在肿瘤的发生过程中，抑癌基因的失活比原癌基因的激活起着更关键的作用。人类第一个抑癌基因Rb于1986年分离克隆并鉴定出来。近期研究表明：抑癌基因的点突变、重组、缺失或甲基化所致的功能失活与多种人类恶性肿瘤的发生及发展有关，在肿瘤细胞转化过程中，抑癌基因功能的失活比原癌基因的激活起更关键的作用。抑癌基因编码的蛋白质广泛存在于各种细胞中，主要有以下功能：诱导终末分化；维持基因稳定；触发衰老，诱导
2、细胞程序性死亡；控制细胞增殖；抑制蛋白酶活性；改变DNA甲基化酶活性；调节组织相容性抗原；调节血管生成；促进细胞间联系。近几年来关于泌尿系统肿瘤抑癌基因的研究取得了重要进展，发现了许多新的抑癌基因，现综述如下。1 抑癌基因p16、p21、p27的研究进展p16细胞周期是细胞增殖分化的最后共同通路。静止期细胞在受到增殖原刺激后，从G0/G1期向S期、G2期及M期过渡，如果有增殖原的不断刺激，细胞在经过M期后进入G1期并继续下一个周期，如果失去增殖原刺激，细胞停止于G1期不再向S期过渡而停止增殖，进入G0期。在细胞周期的各个间期中，以C1期最为重要，许多细胞外及细胞内的增殖调近代物质主要作用于该期
3、，G1期的后期存在一个限制点，在此点以前，细胞周期的传递以依赖增殖信号的方式进行，在未通过限制点以前，若推动增殖原刺激，细胞周期则不再向前进行而回到G1期的起始点；通过该点以后，细胞周期则不同志依赖于增殖原的刺激而自行向前推进，此时，增殖原存在与否不再影响细胞周期的传递，限制点以限速方式对细胞周期进行调控。限制点的形成与作用机制目前尚未完全明了，但大量研究发现视网膜母细胞瘤基因的蛋白产物的磷酸化 dNA复制所需的蛋白表达关系密切。在静止期细胞中，Rb呈低磷酸化状态，非磷酸化的Rb与转录因子E2F等结合而使其失活，细胞受到增殖原刺激后Rb被磷酸化而与E2F解离，从而启动转录。Rb的磷酸化与细胞内
4、周期素依赖激酶的活性有关，与Rb磷酸化关系最为密切的CKDS有CDK4、CDK6等，CDKS只有与其正调节物同期素结合成cyclins-CDKS复合物才能发挥激酶活性，使Rb磷酸化，启动转录。CDKS的活性除受到cyclins的正调节外，还受到其抑制物的负调节，其中抑癌基因p16的蛋白产物p16蛋白是最重要的一种抑制物。p16蛋白主要与CDK4结合而使之失活，CDK4的失活在很大程度上影响了cyclins-CDKs复合物的活性，Rb蛋白的磷酸化也就受到了抑制。Kamb等的研究发现肾癌细胞中p16基因的缺失率为56%，膀胱癌为33%。有学者报道p16基因传染到膀胱癌细胞中可引起肿瘤细胞生长减慢，
5、致瘤性降低，提示p16基因的失活与泌尿系肿瘤的发生发展密切关联。Herman等1检测了26株肾癌细胞系中p16基因的表达情况，结果有13株出现了p16基因的纯合性缺失，其中6株有5端CpG岛异常甲基化。KamB等也在9株肾癌细胞系中发现有5株出现p16基因的纯合性缺失，序列分析未发现p16的点突变。Spruck等报告31例原发性膀胱癌中有6例为p16纯合性缺失，无一例突变。上述研究表明p16的纯合缺失可能是它失活的主要方式。Gu等对30例前列腺癌患者行SSCP分析，仅2例存在p16第2外显子的改变。即148密码由GA，由此氨基酸由Ala变成Thr，他们也认为，突变并不是p16失活的重要途径，而
6、DNA甲基化常导致p16的失活。随着对p16基因的进一步认识，近来多数学者认为，由于p16基因片段小，作用专一，它用于基因治疗优越于p53，而且可以生产出模拟p16蛋白功效的药物以替代缺失的p16，进而达到抑制人体内多种肿瘤生长的目的。p21Lacombe等检测了27例原发性膀胱癌细胞p21的表达及其编码的产物，通过序列分析显示1例发生点突变，其他病例表现在322位点发生了移码突变和8个核苷酸缺失。Dangle s等对人膀胱癌细胞系的研究后发现p21的过度表达可诱导癌细胞发生凋亡。Shiohara等研究发现p21突变在肿瘤的进程中所起的作用并不十分重要，在很多肿瘤中未检测到p21的突变。但在肾
7、细胞癌、结肠癌等有p21区域染色体的基因缺失，如Hughson等用PCR-RELP和微卫性分析法对13例乳头状和非乳头状肾细胞癌进行p21的检测，发现10例非乳头瘃肾癌中的8例发生了p21等位基因的丢失，3例乳头状肾癌中的1例发生了p21的杂合性缺失。说明p21在人类恶性肿瘤中的改变主要是基因片段的缺失。p271994年Polyak等在研究细胞间接触抑制和TGF-诱导细胞生长停滞于G1期的机制时，从静息的细胞抽提物中发现一个27kd的热稳定蛋白质，称之为p27kipl，它具有抑制cyclin e-CDK2复合物的活性，对细胞周期具有负调控作用，被公认具有抑癌基因活性。随后Pietenpol等利
8、用p27cDNA作探针筛选得到定位于人染色体12p13的p27基因，它包含2个外显子和2个内含子。人p27cDNA长569bp，含198个氨基酸。现已证实在大多数的哺乳动物细胞中存在p27，在真核细胞的细胞周期调控中起重要的作用。p27作为细胞周期的负调控因子，具有阻止细胞通过G1/S期转换的“关卡”作用，从而抑制细胞的增殖，使细胞有机会修复损伤的DNA或DNA复制中产生的错误。Polyak等的实验表明，p27在蛋白表达水平及活性的改变与肿瘤的形成有关。有人用Stanrosporine在离体的细胞实验中上调p27的表达，结果使膀胱癌细胞系5637的生长受到抑制。Chen等用包含p27cDNA的
9、腺病毒载体传染低水平表达p27的星形胶质瘤细胞，获得p27过度不定期达的细胞失去了瘤细胞的生长特性，停滞于G1期的细胞和非整倍体细胞数明显增多，而经Adp27传染的细胞在祼鼠中不能形成肿瘤病灶。Cote等用免疫组化方法检测了96例前列腺癌组织标本中p27的表达水平，结果发现7在肿瘤组织中的表达随着肿瘤分级水平的上升而显着下降，而且与肿瘤的复发、患者存活率的降低有显着的相关性。上述结果表明，p27蛋白表达水平的改变在泌尿系肿瘤的发生中起着重要的作用。2 新的抑癌基因PTEN的研究进展新近发现的PTEN基因位于10q23，这个基因编码一个双重特异性的蛋白磷酸酶。研究发现在人类多种肿瘤如膀胱癌、肾癌
10、、前列腺癌、神经胶质瘤、甲状腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞中有点突变和缺失。Cairns等10用微卫性分析法检测345例泌尿系肿瘤标本，发现在23%的膀胱癌、25%的肾癌中发生了染色体10q的缺失或突变，进一步的研究表明65例膀胱癌中的4例PTEN表现为纯合性缺失，而所有15例肾癌均表现为杂合性缺失。许多细胞遗传学家曾报道在前列腺癌组织中染色体10q经常发生杂合性缺失，缺失定位图的研究显示染色体10q23有一个微小区域的丢失。Carins等11在检测了80例前列腺癌标本后发现有23例发生了10q23的缺失，并且随着肿瘤分期、分级的增加PTEN的缺失率也相应明显提高。Wang等12报道4株前列腺癌细胞中
11、有3株发生PTEN等位基因失活，他们用Southern印迹法和微卫性法及PTEN探针对60例B期前列腺癌患者进行检测。8例有PTEN的纯合性缺失，2例发生了PTEN的杂合性缺失。Kuczyk等13也认为PTEN的突变与前列腺癌的发生有密切的关系。3 新的抑癌基因候选者-FHIT的研究进展FHIT基因是由Ohta等14于1996年克隆的一个拟定的抑癌基因，它位于染色体3914-2，其全长500kb，由10个外显子组成，cDNA长1095bp，转录产物则相应为的mRNA。由该基因cDNA推算的蛋白质与具有三价组氨酸结构域的HIT蛋白高度同源，故命名为FHIT基因。FHIT基因包含脆性部位FRA3B
12、和t易位断裂点，编码的蛋白质是一种 典型的Ap3A水解酶。Le等15四个研究小组采用不同的方法克隆出同一抑癌基因FHIT，与其它被克隆的基因片段不同的是，FHIT具有如下2个特点：不稳定，似乎有一段由500kb组成的长链DNA，极易断裂；序列分析未见重复的三核苷酸结构单元，是一个少见的脆性位点。脆性位点发生断裂，则会使包含脆性位点的FHIT断裂、失活，引起细胞基因变异，最终导致细胞的异常增生。FHIT在所有人类组织中均有低水平的表达，其蛋白序列与酵母的二核苷四磷酸不对称水解酶有69%的同源性，提示两者功能相似。目前积累的资料表明，FHIT异常和众多肿瘤发生相关，不仅和消化道、呼吸道肿瘤，也和乳
13、腺癌、肾癌16,还可能与卵巢癌、白血病和膀胱癌等相关。早在1979年，Cohen等就观察到一意大利家族成员出现早发、双侧、多灶的肾透明细胞癌与t易位使FHIT基因的表达受到了干扰。Sanchez等发现将3P14-p12片段导入t易位的肾癌细胞可部分抑制肾癌细胞在祼鼠体内的生长。Hadazek等17用免疫组化方法检测了41例肾癌细胞中FHIT的表达，结果在正常肾小管上皮细胞FHIT为均匀的强阳性，而51%的肿瘤细胞为阴性表达，34%为混合表达，14%为弱阳性表达。他们通过进一步的研究发现，G1期肿瘤细胞中FHIT完全缺失，G2、G3期为混合表达，而且G3期大部分细胞中为阴性表达，作者认为在G1期
14、中FHIT失活与肿瘤的进展密切相关。另一些研究也认为FHIT的缺失或其产物机能的丧失对肾癌的发展有潜在的作用。他们的研究都证明了FHIT在肾癌的发生中起重要作用。迄今为止的研究发现，肿瘤中FHIT基因没有点突变，而主要表现为缺失一个或数个外显子，Exon5和Exon8为缺失的热点。Shridhar等18在94例肾癌标本中有69例发生了包括FHIT基因在内的3P14序列的杂合性缺失。在家族性肾癌细胞中Exon2a和Exon3都是缺失的，Luan等19在分析了肾癌组织和细胞中FHIT的表达后发现，几乎60%以上的病例其FHIT的cDNA中Exon8完全丢失。在许多其他肿瘤中，如胃癌、食道癌、结肠癌
15、、肺癌、乳腺癌及胰腺癌中也发现了FHIT的高比例缺失。但Bugert等20采用RT-PCR和微卫性缺失定位图分析106例非乳突状肾癌，发现仅有3例在FRA3B/FHIT区域显示断裂点,而且除1例以外，其余的肾癌细胞中均有正常的FHIT转录，故认为FHIT基因在肾癌的发生中所起的作并不重要。总之，FHIT作为新的抑癌基因候选者，其缺失和众多肿瘤的发生、发展关系密切，要确定其为典型的抑癌基因还有赖于进一步研究其分子机制和蛋白质功能。参 考 文 献1 Herman JG,etRes,1995;55:45252 Gu K,etCarcinog,1998;21(3):1643 Lacombe L,etR
16、es,1996;8(1011):4094 Dangles V,etRes,1997;57(16):33605 Hughson MD,etGenet Cytogenet,1996;87(2):1336 Rivard N,etBiol Chem,1996;271(31):183377 Zi X,etRes,1998;58 (9):19208 Cote RJ,etNatl Cancer Inst,1998;90(12);9169 Bostron J,etRes,1998;58(1):2910 Cairns P,et ,1998;16(24):321511 Cairns P,etRes,1997;57(
