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1、摘要】 目的 测定心房肌钙转运调控蛋白和钙激活中性蛋白酶（calpain 1）的mRNA表达，探讨风湿性心脏瓣膜病（风心病）心房颤动（房颤）患者心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制及其在房颤发生、维持中的作用。方法 采集风心病窦性心律组患者12例和房颤组患者16例的右心耳组织，应用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法，测定心房肌钙转运调控蛋白和calpain1的mRNA表达水平。结果 与窦性心律组相比，房颤组L型电压依赖钙通道a1c亚基(LVDCCa1c)、肌浆网Ca2+ATP酶、兰尼碱受体（RYR2）的mRNA表达水平明显下调（均为P0.01），三磷酸肌醇受体(IP3R
2、1) 的mRNA表达水平上调（P0.05），房颤组心房肌calpain1的mRNA表达水平上调（P0.05），且与LVDCCa1c的mRNA表达呈负相关（r=0.583，P0.05）。结论 房颤患者心房肌钙转运调控蛋白和calpain1转录水平调控失衡可能是心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制之一，与房颤的发生和维持有关。 【关键词】 心房颤动； 钙转运调控蛋白； 钙激活中性蛋白酶； 基因表达 Alterations in gene expression of calcium handling proteins and atrial calpains in chronic at
3、rial fibrillation patients with rheumatic heart disease XU Guojun1, TANG Baopeng1, YUNUSKurexi2, SHABITIYilihamujiang2, ABUTIREHEMENMulati3, CHENG Zuheng1. 1.Department of Cardiology；2.Key Lab of Local Disease;3.Deparement of Cardiac Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,
4、 Xinjiang Urmuqi 830054, China Abstract：Objective To investigate the molecular mechanisms of chronic atrial fibrillation (AF) by assessing gene expression of calcium handling proteins and atrial calpains in AF patients. Methods A hundred microgram of tissue of right atrial appendages was obtained fr
5、om 16 rheumatic heart disease patients with AF and 12 matched rheumatic heart disease patients with sinus rhythm (as control) during cardiac operation. The mRNA expression of calcium handling proteins and atrial calpains were assessed by semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reactio
6、n (RTPCR) and normalized to the mRNA level of glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase. Results mRNA level of calpain1 was significantly increased (P0.05) and mRNA level of LVDCCa1c was significantly decreased (P0.01 ) in AF group than in sinus rhythm group. mRNA level of LVDCCa1c was negatively corre
7、lated to that of calpain1(r=0.583，P0.05 ). Compared to sinus rhythm group, AF group had significantly decreased levels of sarcoplasmic reticulum(SR) calcium adenosine triphosphatase (Ca2+ATPase) and ryanodine receptor type2mRNA (P0.01 ) and significantly increased level of inositol triphosphate rece
8、ptor type1mRNA (P0.05). Conclusions Chronic AF is predominantly accompanied by abnormal regulation in the mRNA expression of proteins influencing the calcium homeostasis and atrial calpain1, which are related to both electrical remodeling and structural change and may influence the initiation and ma
9、intenance of AF. Key words： Atrial fibrillation; Calcium handling proteins; Calpains; Gene expression 心房颤动(房颤)主要的特征是电重构和心功能下降。房颤时心房肌电重构在房颤的自身维持中发挥重要作用。研究显示，细胞内钙超载在房颤电重构中起重要作用1。电重构是可逆的，相比之下，心房的收缩功能在转为窦性心律后却恢复得较慢2，这表明除电重构以外，还有其他因素影响着房颤患者心房的功能。钙激活中性蛋白酶（Calpains）是一类钙离子依赖性的中性蛋白酶，激活后可以使收缩蛋白部分降解，肌丝反应性降低，引起
10、心肌收缩功能的抑制3。本研究通过观察慢性房颤患者心房肌钙转运调控蛋白和calpain1的mRNA表达改变，探讨房颤患者心房肌电重构和结构重构以及心功能下降的分子生物学机制及其在房颤发生维持中的作用。1 对象和方法 1.1 研究对象 2006年1月至2006年8月在新疆医科大学第一附属医院接受开胸换瓣手术的28例风心病患者，男性10例，女性18例，年龄 (41.628.56)岁（3260岁）。按其有无房颤分为：窦性心律(窦律)组12例，房颤组16例，房颤持续时间超过6月。术前1周每例行心电图、超声心动图等常规检查，部分患者行冠状动脉造影排除冠心病。所有病例均无肝肾功能损害、电解质紊乱及感染，无高
11、血压、糖尿病，心功能均在级(NYHA分级)，半年内均未应用钙离子拮抗剂。 1.2 研究方法 1.2.1 标本采集 心脏手术中建立体外循环，心脏停跳前获取右心耳组织约100 mg，除去血液和脂肪组织后迅速置入液氮，然后转入80深低温冰箱冻存备用。 1.2.2 RNA提取 取心房组织约100 mg，用TRIZOL(Invitrogen公司)一步法提取组织总RNA，将RNA溶于40 l去核酸酶(DEPC处理)的水中，80冻存备用。所有标本吸光度D（）260/D（）280均为1.72.0。 1.2.3 半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR) (1)取2 g总RNA逆转录成cDNA；(2)引物设计与合
12、成：检索基因库各目标基因和三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA序列，由TaKaRa公司合成。LVDCCa1c上游：5ACA AGA ACC AGC GAC AGT G3下游：5GGG TTT GAA GGC AAT GAG C3，扩增片段 278 bp；Ca2+ATP酶 上游：5TTG CAT TGC AGT CTG GAT CA3下游：5TCC AAA GCA GAG TCA TTA CA3，扩增片段484 bp；RYR2上游：5AAG TGC CAG AGT CAG CAT TC3下游：5AGT AGT ATC CAA TGA TGC AG3，扩增片段453 bp；IP3R1上游：5T
13、TA GCA AGA TGG CGA AAG G3下游：5GAG CAG GAC ACG GAG AAA GG3，扩增片段453 bp；Calpain1上游： 5GCA CAG ACA TCT GCC AGG GAG C3下游： 5GCC TGT GAA GTC CTC AAA GCC C3，扩增片段 332 bp；GAPDH上游：5CCC CAC ACC ATC TTC CAG GAG CG3下游：5GGC AGG GAT GAT GTT CTG GAG AGC c3，扩增片段411 bp；(3)PCR反应体系(25 l)：cDNA2 l(约0.25g)，25 mmol/L MgCl2 1.
14、5 l，10Buffer 2.5 l，10 mmol/L dNTP 0.5 l，Taq酶2 U，目标基因上、下游引物各0.2 mol/L，内参照基因上、下游引物各0.1 mol/L，加去离子水至25 l。(4)反应条件：94预变性5 min，随后进入PCR循环，94变性30 s，褪火45 s，各目标基因褪火温度依次为54、56.8、58.5、56.3、60.7、54，72延伸60 s，30个循环后72延伸10 min。PCR反应试剂购自TaKaRa公司。(5)阴性对照：反应体系中未加入模板总RNA，代之以去离子水，其他如反应体系、反应条件等无改变。 1.2.4 电泳及图像的半定量分析 取PCR
15、产物5 l，用1.5%琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色，在BIORAD凝胶成像系统上扫描，测目标基因和内参照基因的电泳条带灰度积分，以二者比值代表目标基因的相对表达含量。 1.3 统计学处理 各指标测值以均数标准差（s）表示，两组间比较采用检验，变量间相互关系采用直线相关分析。统计处理均由SPSS11.5软件包完成，P0.05有统计学意义。2 结果 2.1 一般资料 如表1所示，除年龄外，两组间其他临床资料如性别、左房内径、右房内径、左室射血分数和心功能HYHA分级等差异无统计学意义。 2.2 钙转运调控蛋白和calpain 1的mRNA表达注：HYHAC为纽约心脏病协会心功能分级；与窦性心律组比较，aP0.05 中图15号为窦律组，610号为房颤组；中15号为窦律组，610号为房颤组；中15号为房颤组，610号为窦律组；中15号为窦律组，610号为房颤组；中15号为房颤组，610号为窦律组；为内参照基因。 标基因和内参照基因GAPDH的扩增条带位置与理论值相符。 2.3 房颤组钙转运调控蛋白mRNA表达 与窦律组相比，房颤组
