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1、 微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪 9 董天涵 8怡菲 8 逄颖5【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤 、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。 （2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。 （3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。 （4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配
2、制的适合微生物生长繁殖或积累代产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的围。已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生
3、物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。 接种的关键是要严格的进行无菌操作。 鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，菌种在平板上划线。通过划线将样品在平板上稀释，培养后能形成单独的菌落。平板计数法是将测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌
4、落。统计并记录菌落数。（4） 细菌的分离与纯化为了得到单一菌种，要对培养的菌分离和纯化。用接种环挑起培养基里少量菌在无菌条件下接种到新的培养基上，划线，继续进行培养，从而得到新的单一菌落。3.实验器材（1）器材：培养皿、载玻片、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、镊子、恒温培养箱、高温灭菌锅、 无菌操作台 、 天平、滤纸、pH试纸等 。（2）试剂：配制牛肉膏蛋白胨培养基的原料（牛肉膏、NaCl、琼脂、蛋白胨）、配置高氏I号培养基的原料（可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4，MgSO4 7H2O，NaCl，FeSO4 7H2O，琼脂 ，pH=7.4-7.6）配制查氏培养基的原
5、料（硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、蒸馏水）配制无氮培养基的原料（葡萄糖，K2HPO4，MgSO4 7H2O，NaCl，CaSO4 2H2O， CaCO3，pH=7.0-7.2）（3）菌种：土壤稀释液4.实验步骤（1）高氏培养基的配制培养基的配方： 可溶性淀粉20.0 g KNO31.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 7H2O0.5 g NaCl 0.5 g FeSO4 7H2O0.01 g 琼脂20 g 自来水1000 mL pH 7.47.6 淀粉琼脂培养基（高氏一号），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。操作流程：称量溶解分装包扎灭菌* 调PH一
6、步省略不做操作步骤：a.称量和溶解：按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入小于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全熔化。然后再称取其它各成分依次熔化。对微量成分FeSO47H2O可先配成高浓度的储备液，按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O，配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mL的0.01g/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后补充水分都所需的总体积。将称好的琼脂放入上述已溶的药品中，加热使琼脂熔化，期间不断搅拌，最后补足加热过程中损失的水分。 注意：琼脂熔化过程中应控制火力，一面培养基因沸腾而溢出
7、容器，同时，需不断搅 拌，以防琼脂糊底烧焦。 b.分装：将配好的液体培养基均匀装入8支试管，每支试管的液体量以倾斜试管液 体恰好成对角线铺满试管为标准。剩余培养基液体分装入两个三角烧瓶。c.加塞包扎：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口塞上棉塞，以阻止外界微 生物进入培养基造成污染。并用牛皮纸包住试管口和三角烧瓶口，皮筋固定。 并在试管和三角烧瓶全身包上报纸。用记号笔标好培养基名称、组别、配制日期。 d.灭菌：将上述培养基以0.1MPa，121，20min高压蒸汽灭菌。（2）微生物的培养倒平板: 将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基、查氏培养基、无氮培养基加热融化，在无菌操作台上将其倒在16
8、个培养皿中。其中牛肉膏蛋白胨培养倒9个平板、高氏I号培养基倒3个平板、查氏培养基倒3个平板、无氮培养基倒1个平板。* 倒平板的方法：倒平板主要有两种方法：皿架法和手持法我们采用手持法倒平板，具体操作如下：右手持三角瓶至于火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻拔出，保持瓶口对准火焰，左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一条缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿是培养基铺平培养皿底部，然后平置于桌面上冷凝。制备土壤稀释液:称取1g花园土，无菌操作倒入99mL无菌生理盐水中,在震荡器中振荡20分钟, 使微生物细胞分散，静置2030s，即成10-2稀释液；再用 lmL移液器，吸取10-2稀释液lmL，移入
9、装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；再换一支无菌吸头吸取10-3稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，即成10-4稀释液；以此类推，连续稀释，制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液（如下图）涂布：将培养基平板编号，然后用移液枪吸取10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液各02mL对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（牛肉膏蛋白胨培养基每个编 号设三个重复，查氏、高氏各一个）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀 （如下图），每个稀释度用一个灭菌涂布棒；更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。无氮培养基接种用点液法。*涂布方
10、法：将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分散均匀，然后改变方向90沿另一直线来回推动，平板边缘处可改变方向用涂布棒再涂布几次，室温下静置510min。培养:将涂布好的平板平放于桌上1020min，使菌液渗透入培养基，然后将平板 倒转。牛肉膏蛋白胨培养皿置于37培养箱中、高氏I号、查氏、无氮培养皿置于28培养箱，两天后观察。记录并观察各菌落的生长情况。（3）平板划线分离微生物连续划线分离：在近火焰处啊，左手拿皿底，右手拿接种环，挑使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中挑取少量菌样，在相应培养基平板划线分离（如图），划 线的方法多样，目的是获得单个菌落。5、实验结果记录(1)各培养基上菌
11、的生长情况牛肉膏蛋白胨培养基细菌 查氏培养基霉菌高氏培养基放线菌 无氮培养基无氮菌划线分离后细菌落图(2)不同菌落形态特征的描述菌落特征记录表菌落名称细菌放线菌霉菌固氮菌菌落特征大小大小大中形态圆形圆形不规则不规则干湿湿润干燥干燥粘稠高度扁平扁平隆起隆起透明度半透明不透明不透明半透明颜色黄色淡粉色绿色乳白色边缘不整齐整齐不整齐不整齐（3）平板菌落计数结果10-4平均10-5平均10-6平均牛肉膏30264（有污染)20151216193（有污染)544查氏 23 177高氏 754无氮 0原始数据记录CFU记录表稀释度菌种10-4平均10-5平均10-6平均细菌1.5e61.3e60.2e61
12、e67.5e66e69e67.5e61.5e72.5e72e72e7霉菌1.15e6-8.5e6-3.5e7-放线菌3.5e5-2.5e6-2e7-* 每毫升中的cfu数=同一稀释度三次重复的平均菌落数*稀释倍数*56.实验结果与讨论（1）实验中的问题及原因分析：制备培养基时出现的问题：加热熔解琼脂时液体剧烈沸腾溢出三角烧瓶，导致实验重新进行，浪费了人力物力，由于搅拌不够，出现了糊底的现象。以后的实验中要引起足够的重视接种操作时没有尽量避免外界细菌的掺入，使得最后培养得到的菌落掺杂了空气中的杂菌，而在灼烧接种环时因接种环过热使得一部分菌体被杀死。无氮培养基没有长出无氮菌，本组用的无氮培养基太薄，再加上土壤稀释液点的太多，本来
