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1、蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。二、原理考马斯亮蓝G250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在01000g范围内，蛋白质一
2、色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。三、仪器、试剂和材料1仪器 （1）分析天平 （2）具塞刻度试管 10ml 8 （3）吸管 0.lmlI，lmlZ，5mlI （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心管 10ml （7）容量瓶 10ml （8）离心机 （9）721型分光光度计2试剂 （1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pgml的原液。 （2）考马斯亮蓝G250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50ml 90乙醇中，加入 85（mv）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。此溶液在常
3、温下可放置一个月。3材料 绿豆芽四、操作步骤1标准曲线的制作 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。管 号操作项目 1 2 3 4 5 6标准蛋白质溶液(ml) 0 0.2 0.4 0. 6 0.8 1.0蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0G-250试剂(ml) 各5蛋白质含量（g） 0 20 40 60 80 100盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（g）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2样品中蛋白质含量的测定（1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研
4、成匀浆，离心（4000rmin，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。（2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。五、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g），按下式计算： 样品蛋白质含量（gg鲜重）（查得的蛋白质含量（g）提取液总体积（ml）（样品鲜重（g）测定时取用提取液的体积（ml）六、注意事项 比色应在出现蓝色2 mi
5、nl h内完成。作者：吕淑霞 来源：生物秀 时间：2008-5-21一、目的学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是197
6、6年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为01 000gmL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、材料、主要仪器和试剂1实验材料新鲜绿豆芽2主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000gmL 的原液。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-
7、250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。（3）乙醇（4）磷酸（85）四、操作步骤1标准曲线制作（1）0100gmL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。表1 低浓度标准曲线制作（2）01 000gmL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01 000gmL 的标准曲线。表
8、2 高浓度标准曲线制作2样品提取液中蛋白质浓度的测定（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.51h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL 容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD5
9、95nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（g）。以标准曲线1 号试管做空白。五、结果计算式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（g）。六、附 注1Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。2有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。3蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。七、思考题1制作标准曲线
10、及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？参考答案1将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。溶液：1）Bradford储存液 1
11、00ml95%乙醇 200ml88%磷酸350mgServaG蓝 室温下长期保持稳定。2）Bradford工作液 425ml双蒸水 15ml95%乙醇 30ml88%磷酸 30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。注意事项：1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。2、上样量的问题， ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白浓度
