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1、 大景深显微镜原理及其应用 （哈尔滨工业大学土木学院，黑龙江哈尔滨150001）摘要：本文论述了大景深显微镜原理，相关的理论基础，以及增大景深的经典方法，最后论述了大景深显微镜的应用。关键词：大景深 增大景深 缩小孔径引言 增大光学成像系统的景深一直以来都是应用光学领域的研究热点。自上世纪60 年代由 Welford 提出环形孔径增大景深方法以来，又出现了很多其他的方法。比如幅度切砋法，二维图像序列的图像融合，特殊设计透镜结合图像处理，加载相位模板的普通镜头结合图像处理（波前编码），三维数字全息等等。大景深光学成像系统可以应用于很多领域，比如生物或医学样品的三维显微成像、机器视觉、红外成像、空
2、间光学成像、手机摄像头、数码相机等等。1 大景深的概念景深是指在固定像平面上成清晰像时对应的物方深度范围，也就是说在保证得到清晰像时物体能够在物方空间前后移动的最大距离。通常的光学成像系统的景深范围是有限的，当通过某种方法使得成像系统的景深增大后，就称此时的成像系统是大景深成像系统，此系统具有大景深特性。2 大景深光学成像系统的理论基础大景深光学成像系统理论是基于标量衍射理论。大景深光学成像系统是在普通光学成像系统的光瞳处增加特殊设计的相位模板并结合后续的图像复原来实现的。标量衍射理论是指用一个光源照明不透明屏幕上的一个孔径时，在屏幕后一定距离的平面上观察光强的分布，会发现边界处的光强是从明到
3、暗的渐变过渡，而非微粒学说所预言的突变。如果采用质量更好的光源，会看到明暗条纹的存在一直扩展到屏幕的几何阴影区内很远的地方。这就是衍射现象。索末菲把衍射定义为“不能用反射或折射来解释的光线对直线光路的任何偏离”。解释衍射现象的理论经历了四个历史阶段，首先是 1678 年惠更斯（波动学的最早倡议者）给出了一个直观信念：把光扰动的波前上的每一个点都看成是一个“次级”球面扰动的新波源，那么随后任一时刻的波前可以由这些次级子波的包络得到；接着，1818 年菲涅耳对惠更斯的直观信念进行了很大改进，用杨氏干涉理论补充了惠更斯的包络作图法。通过对惠更斯的次级波源的有效振幅和位相做一些任意的假定，并且让各个子
4、波相互干涉，以极高的精度计算出衍射图样中的光场分布；随后，1882 年基尔霍夫通过两个关于投射到放在光的传播路径上的障碍物的表面上的光的边值条件假定，建立了坚实的数学基础，证明出菲涅耳的想法是光的波动本性的逻辑结论；1894 年索末非发现了菲涅耳理论中两个假定的自相矛盾，得到了瑞利-索末菲衍射理论。基尔霍夫理论和瑞利-索末菲理论都是做了某些主要的简化和近似的，尤其是把光作为标量现象来进行处理，也即是只考虑电场或磁场的一个横分量的标量振幅，而假定任何别的有关的分量可以用相同的方式独立处理。这忽略了一个事实：电场矢量和磁场矢量的各个分量是通过 Maxwell 方程组耦合起来的，并不能相互独立处理。
5、不过实验表明，标量理论在满足以下两个条件时能够得出非常准确的结果：1）衍射孔径必须比波长大得多；2）不要在太靠近孔径的地方观察衍射场。2.1 大景深光学成像系统模型原理图采取增大景深的方法，即在普通光学成像系统的光瞳或者孔径光阑处放置一块特殊设计的相位模板来对成像波前进行调制，使得光学成像系统的光学传递函数体现出离焦不变性，接着对CCD等成像器件得到的数字图像进行图像复原操作，从而得到大景深的较清晰图像，原理方框图如图1所示。而且大景深光学成像系统的光路图如图2，其中CCD成像芯片所在像面的像距为 di，CCD的共轭物距为do，da为物方轴上某点所对应的物距。这里的do，da和 di没有考虑符
6、号问题。规定离焦量zdo-da。z0称之为近离焦。图1 大景深光学成像系统原理框图图2 大景深光学成像系统的成像光路示意图3 经典的增大景深的方法缩小孔径对于普通光学成像系统而言，最方便的增大景深的方法就是缩小孔径光阑的通光口径。但是随着孔径的缩小，输出的成像光能量急剧衰减，并且系统的截止频率也会随之下降，从而导致成像质量下降。图4所示的为普通的圆形孔径对应的成像系统在缩小孔径过程中不同离焦条件下所对应的点扩散函数PSF以及幅度调制函数MTF的变化曲线以及MTF密度图。图中的W20是离焦参量，单位为波长。W20为0代表系统良好聚焦。其中的点扩散函数 PSF 曲线均以全口径（系统孔径光阑直径最大
7、时）良好聚焦时中心光强作为归一化因子，此外对系统的 MTF 的空间频率进行了归一化处理。从点扩散函数可以看出，当孔径变为最大时的0.75 时，良好聚焦位置对应的中心光强变为原来的0.32；孔径变为原来一半时，对焦面中心光强已经变为0.06。并且，随着孔径的缩小，弥散斑的尺寸也在不断增大。从 MTF 曲线可以看到，随着孔径的缩小，最大截止频率从全口径时的2降到了0.5口径时的1。系统景深增大的程度可以从MTF密度图中看出。横坐标是代表离焦的参数，纵坐标为归一化空间频率，图形的灰度图表示不同离焦不同空间频率上对应的MTF值，灰度值越大表示MTF值越大，越小表示MTF值越小。成像系统的景深可以表述为
8、在满足所需的成像分辨率（空间频率）要求下系统所允许的最大离焦范围，所说的空间频率要求为在小于该空间频率的范围内，系统的MTF都要大于某个设定的值，比如对于某些识别系统，这个值可以设定为0.08。在图 4（d）中，每个图形中的白色方框所围成的区域对应的横坐标区间即为景深范围。因此，可以得出全口径对应的景深1，0.75 口径时景深2，0.5口径时景深为4.5。从中我们也可以看到截止频率的下降。图4 普通光学成像系统缩小孔径增大景深时对应的特性曲线4 大景深光学成像系统的应用经典光学成像系统的景深通常都是受到系统结构限制的，而在不少应用领域要求成像系统具有更大的景深，以达到普通光学成像系统无法达到的
9、成像目的。下面就介绍大景深光学成像系统的几种应用：4.1 生物或医学样品的三维显微成像在生物或医学的研究以及应用领域，经常需要观察样品的三维结构，而某些被研究样品在成像光轴方向的厚度大于显微成像系统的景深。这就造成了单次成像时只能够得到样品部分清晰的图像，而其他部分则是模糊的，如图5中的（a）-（e）所示。为了得到样品总体清晰的图像，通常的方法是对样品进行不同厚度位置的聚焦成像，然后对得到的序列图像进行图像融合，得到所需要的清晰的大景深图像。图5 中（a）-（e）所示的为从鼠眼多次成像得到的序列图像中抽出的几张图像，图（f）为最后得到的融合图像。序列图像的获取过程决定了较长的总体清晰图像的获取
10、时间。如果样品是静态的，问题并不严重。如果样品是活体，或者是在显微系统下移动的，那么问题就出现了，我们无法根据多次聚焦成像得到的序列图像融合得到样品的总体图像，因为不同的图像采集时刻样品已经变化了。大景深成像系统则可以避免通常显微成像系统对于样品厚度或者样品变化的苛刻要求。它可以通过单次成像得到样品的清晰的整体图像，而无需多次成像融合过程，从而实现对于活体样品或者变化样品的实时观察研究。图5 鼠眼的部分序列图像及其整体融合图像4.2机器视觉系统这里所说的机器视觉系统，如条形码识别系统、人体生物特征识别系统、IC芯片实时检测系统、工业零件的机器视觉检测系统等等。其中的人体生物特征，比如指纹、虹膜
11、等，可以替代传统的密码，用于电子商务，安全检查，员工、学生、囚犯等的识别等方面。机器视觉系统对目标物体的位置以及系统的安装都有着严格的要求，即必须保证系统处理的目标物体处在成像系统的景深范围之内。一旦物体由于倾斜、放置偏差等原因造成部分或全部处在景深之外，那么相应的图像将变模糊而无法用于后续的处理过程。此外，在生物或医学样品的三维显微成像中遇到的物体厚度超过景深时的问题也会出现在机器视觉系统中，并且，有不少检测系统是对生产线上的物体进行检测，如图6 中的（c-1）所示的螺栓，螺栓的厚度超过了成像系统的景深，采用图像融合的方法不可行。图6 的上面一行是普通光学成像系统得到的图像，下面一行是大景深
12、光学成像系统得到的图像。图6 大景深成像系统在机器视觉中的应用最简单的增大机器视觉系统景深的方法是缩小系统的孔径光阑，这会造成输出图像的光能量平方倍地衰减，虽然可以通过增大光照强度保证成像光强。但是，缩小孔径光阑还会造成成像分辨率以及信噪比的下降，这是普通光学成像系统无法弥补的。如图7所示。图7 普通光学成像系统缩小孔径增大景深前后图像对比大景深成像系统可以降低机器视觉系统的严格的安装要求以及对目标物体放置的要求，降低了系统实现的难度。同时，对于超过传统景深范围的生产线上的被检测物体可以实现实时的图像检测任务。4.3 红外光学成像系统用于红外成像的光学元件的折射率随温度的变化是普通玻璃的20倍
13、。从而，在实际应用中的红外光学成像系统通常都需要提供相应的焦面补偿或者温度控制装置。折射率的变化造成的主要像差是离焦，而大景深成像技术则完全可以消除离焦的影响。从而可以减去机械补偿或者温度控制环节，大大降低系统的重量、简化结构、降低成本。4.4. 空间光学成像系统对于空间光学遥感成像系统而言，环境的变化如温度变化、大气变化，会引起光学系统的像面离焦，致使光学系统的调制传递函数(MTF)下降，从而直接恶化了系统的成像质量。目前解决问题的方法通常是, 采用温控系统或自动焦面补偿装置的方法。但这往往会增加整个系统的重量和功耗, 并使有效载荷成本上升。这对于遥控系统的小型化，轻型化是极为不利的。类似与
14、红外光学成像系统，大景深成像技术应用于空间光学成像系统之中，可以大大简化系统的结构，降低系统的重量，使得遥感系统更加小型化、轻型化。4.5 手机摄像头及其数码相机领域传统的手机摄像头和数码相机成像时，都需要花费小段时间进行对焦操作，从而丧失对“重要瞬间”的成像而造成遗憾。如果采用大景深成像技术，将普通光学成像系统的机械式聚焦过程转换成非机械式的编码和数字信号处理过程，从而处在相机成像视场中的物体的图像随时都是清晰的，没有聚焦相关的延迟，实现瞬时的成像操作。西班牙巴塞罗那著名的CMOS图像传感器厂商OmniVision公司在2005年收购了CDM Optics 公司取得波前编码专利技术（源自于增
15、大光学系统的景深的研究），该技术可大幅减少照相模块尺寸和自动对焦的复杂性。OmniVision公司已将大景深成像技术用于移动电话市场，它利用TrueFocus 技术使得消费者实时获取看到的图像，而不需等待镜头调焦而失去重要瞬间。4.6 内窥成像系统内窥镜成像系统包括通常的医用内窥镜系统和工业用内窥镜系统（比如用于检查喷气式飞机的涡轮叶片的内窥镜）。内窥镜在使用时总会遇到景深太小的问题，即使仪器适当对焦，也很难看清楚聚焦面前后。同时，由于仪器需要经常移动，问题就更加突出。此外，由于内窥镜有严格的光学要求，所以一般成本都比较高。如果采用大景深成像技术，就可以在聚焦面前后具有较大的清晰成像空间。并且，可以采用较少的光学元件达到基本相同的成像效果。在需要高温杀菌的情况下，可以用玻璃元件来组成整个系统；如果不需要杀菌处理，还可以采用塑料元件，从而降低系统的成本。Olympus 公司已经将 CDM 公司的大景深成像技术用于内窥镜产品。5结语景深是指在固定像平面上成清晰像时对应的物方深度范围，也就是说在保证得到清晰像时物体能够在物方空间前后移动的最大距离。通常的光学成像系统的景深范围是有限的，当通过某种方法使得成像系统的景深增大后，就称此时的成像系统是大景深成像系统，此系统具有大景深特性。大景深光学成像系统理论是基于标量衍
