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1、1 超临界流体色谱法 色谱是用于样品组分分离的一种方法，组分在两相间进行分配，一相为固定相，另一相为流动相。固定相可以是固体或涂于固体上的液体，而流动相可以是气体、液体或超临界流体。超临界流体色谱(Supercritical fluid chromatography) 就是以超临界流体做流动相依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。它是集气相色谱法和液相色谱法的优势而在20世纪70年代发展起来的一种色谱分离技术。超临界流体色谱不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分，而且具有比高效液相色谱法更快的分析速率和更高的柱效，因此得到迅速发展。1.1 概述1.1.1 超临界流
2、体及其特性自从1869年Andrews首先发现临界现象以来，各种研究工作陆续展开，其包括1879年Hannay和Hogarth测量了固体在超临界流体中的溶解度，1937年Michels等人准确测量了二氧化碳临界点的状态等等。对于某些纯净物质而言，根据温度和压力的不同，呈现出液体、气体、固体等状态变化，即具有三相点和临界点，纯物质的相图如图 11所示。在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度Tc；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。在临界点附近，会出现流体的密度、粘度、溶解度、热容量、介电常数等所有流体的物性发生急剧变化
3、的现象。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态。温度及压力均处于临界点以上的液体叫超临界流体(Supercritical fluid，SF)。图 11 纯物质的相图超临界流体由于液体与气体分界消失，它的流体性质兼具液体性质与气体性质，见表 11所示。从表 11中的数据可知，超临界流体的扩散性能和粘度接近于气体，因此溶质的传质阻力较小，能更迅速地达到分配平衡，获得更快速、高效的分离。另一方面，密度与液体相似，这样可以保证超临界流体具有与液体比拟的溶解度，因此在较低的温度下，仍然可以分析热不稳定性和分子量大的物质，同时还能增加柱子的选择性。此外，超临界流体的扩散系数
4、、粘度等都是密度的函数。通过改变液体的密度，就可以改变流体的性质，达到控制流体性能的目的。表 11 气体、液体和超临界流体的物理性质的比较名称密度/gml-1粘度/g(cms)-1扩散系数D/cm2s-1气体常压（15-60）(0.6-2)10-3(1-3)10-40.1-0.4超临界流体Tc,Pc-Tc,4Pc0.2-0.50.4-0.9(1-3)10-4(3-9)10-40.710-30.210-3液体（有机溶剂，水，15-60）0.6-1.6(0.2-3)10-2(0.2-2)10-21.1.2 超临界流体色谱法及其特点超临界流体具有液体相似的溶解能力，溶解能力比气体大，能溶解固体物质，
5、这种溶解性质被用于分离过程，最先用于萃取技术-超临界流体萃取法（supercritical fluid extraction, SFE）。后来，将超临界流体用作色谱的流动相，建立了超临界流体色谱法。SFC因其超临界流体自身的一些特性，使得SFC的某些应用方法具有超过液相（LC）、气相（GC）两者的有点，有其独到之处，但它并不能取代这两类色谱，而是它们的有力补充。1. SFC与GC的比较a) SFC可以用比GC更低的温度，从而实现对热不稳定化合物进行有效的分离。由于柱温降低，分离选择性改进，可以分离手性化合物。b) 由于超临界流体的扩散系数比气体小，因此SFC的谱带展宽比GC的要窄。c) SFC
6、溶剂能力强，许多非挥发性组分在SFC中溶解度较大，可分析非挥发性的高分子、生物大分子等样品。d) 选择性较强，SFC可选用压力程序、温度程序，并可选用不同的流动相或者改性剂，因此操作条件的选择范围较GC更广。2. SFC与LC的比较a) 分析时间短，由于超临界流体粘度低，可使其流动速率比高效液相色谱（HPLC）快得多，在最小理论塔板高度下，SFC的流动相速率是HPLC的3-5倍左右，因此分离时间缩短。b) 总柱效比LC高，毛细管SFC总柱效可高达百万，可分析极其复杂的混合物，而LC的柱效要低得多。当平均线速率为0.6 cm/s时，SFC法的柱效可为HPLC法的4倍左右。c) SFC的检测器应用
7、广。SFC可连结各种类型的GC、LC检测器，如氢离子火焰（FID）、氮磷检测器（NPD）、质谱（MS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）以及紫外（UV）、荧光（FLD）等检测器。d) 流动相消耗量比LC更低，操作更安全。通常，在SFC中由于极性和溶解度的局限，使用单一的超临界流体并不能满足分离要求，需要在超临界流体中加入改性剂。在SFC中，选择性是流动相和固定相两者的函数，在GC中溶质的保留受流动相压力及其性质的影响较小，故选择性基本上是固定相的函数，在LC中可用梯度洗脱，改变流动相的性质，从而影响溶质的保留。在SFC中流动相的极性也可采用梯度技术（加入改性剂）加以调整，达到与LC同样的梯度效果
8、。同时，SFC中的压力程序（通过程序升压实现流体的密度改变达到改善分离的目的）相当GC中程序升温技术。1.1.3 超临界流体色谱法的分类超临界流体色谱根据所用的色谱柱不同可分为两种，用填充柱的称为填充柱超临界流体色谱（packed column supercritical fluid chromatography, pcSFC），用毛细管柱的称为毛细管超临界流体色谱（capillary supercritical fluid chromatography），两者各有所长并已建立了相应的方法和理论，相比较而言，毛细管SFC具有更多优点，但目前填充柱SFC应用更广泛些。超临界流体色谱中的填充柱可使
9、用普通HPLC中的色谱柱，目前已有部分商品化专用于SFC的填充色谱柱。根据色谱过程的用途，也可分为两种，分析型SFC和制备型SFC。分析型SFC主要用于常规的分析。制备型SFC常用超临界二氧化碳作为流动相，由于二氧化碳便宜、环保、安全的特点，而得到广泛应用。而且二氧化碳在常温下易除去，样品的后处理过程较制备型HPLC简单，因此制备型SFC应用广泛，特别是在手性制备的领域。1.1.4 超临界流体色谱的发展用超临界流体作色谱流动相是由Klesper等人于1962年首先提出的，他们首先报道了用二氯二氟甲烷和一氯二氟甲烷超临界流体作流动相，成功地分离卟啉衍生物，之后发展了填充柱SFC的技术，用以分离聚
10、苯乙烯的齐聚物。随后Sie和Rijnderder等人又进一步研究了SFC的方法，研究了二氧化碳、异丙醇、正戊烷等作流动相的问题，并以此技术分析了多环芳烃、抗氧化剂、燃料和环氧树脂等样品。60年代末，由于Sie和Giddings等人的卓越工作，解释了SFC在各方面的应用潜力，并于是了SFC的前途极其光明。在这个时间，也是HPLC高速发展的时期，而SFC的发展却不如HPLC那么迅速，这主要是在使用超临界流体时遇到了一些实验方面的问题，所以发展较慢。直到80年代初，SFC才开始焕发出新的光辉，得到了日趋完善的发展。1981-1982年惠普公司在皮茨堡会议上发布了SFC色谱仪，在此期间Berger和G
11、ere等人进行了一系列的研究。此后这一技术得到了迅猛的发展，研究论文数急剧增加，其他科学公司也相继推出了超临界流体色谱的商品仪器。SFC在发展之初，着重于毛细管柱的使用，当时的主要研究者来自于GC领域而非HPLC领域。但是，随后SFC的发展遇到瓶颈，毛细管SFC很难满足药物中极性化合物的分析，而且该技术的一些固有的缺点，仪器条件要求比较高，未能普及应用。此后，填充柱色谱逐渐受到研究者的青睐，它使用与HPLC类似的装置，而且在超临界流体中加入改性剂，增加了流体对化合物的溶解能力，大大增加了SFC的应用对象。近些年SFC的应用主要集中在填充柱SFC上。自SFC技术自上个世纪90年代以来每年发表在S
12、CI上的文章数如图 12所示。图 12 90年代以来SFC在SCI上每年发表文章统计1.1.5 超临界流体色谱的一般流程SFC的一般流程如所示。超临界状态流体源（二氧化碳）在进入高压泵之前预冷却，高压泵把液态流体经脉冲抑制器注入在恒温箱中的预柱，进行压力和温度的平衡，形成超临界状态流体，进入色谱柱。要保持整个系统的压力，在泄压口处装限流器或备压控制器，这也是SFC仪器与普通HPLC仪器最大的差别之处。1.2 基本原理 SFC的流动相主要采用二氧化碳，一氧化氮和氨气等，其中主要使用二氧化碳作为超临界流体。SFC的固定相可采用固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的聚合物，现在研究比较多的
13、是液相色谱的柱填料。分离机理：吸附与脱附，组分在两相间的分配系数不同而被分离。压力效应：SFC的柱压降大（比毛细管色谱大30倍），压力对分离有显著影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）。SFC流体的密度受压力影响显著，在临界压力处具有最大的压力，超过该点，影响小，超过临界压力20%，柱压降对密度的影响较小。超临界流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，色谱峰的出峰时间缩短。1.2.1 超临界流体色谱法的基本概念SFC中的一些基本概念，如保留时间（tR）、容量因子（k）、选择性（）、柱效（N）和分离度（R）等参数，其定义和公式同普通的LC和GC。本节简述相对变数和超临界流
14、体的溶剂力。相对变数（reduced variable），是指某一参数与其临界变数之比值，也叫折合变数、归一变数或简化变数，主要有相对压力（Pr）、相对体积（Vr）、相对温度（Tr）和相对密度（r），定义式为 式中分别为临界压力、临界体积、临界温度和临界密度。图 13 各种具有液体密度的压缩气体与液体的溶剂力比较分度表(1 cal=4.1868 J)超临界流体的溶剂力目前还没有一个严格定义，但可给出一个合理的分度表，Gidding认为，溶剂力主要由“状态效应”（如密度、分子间距离等）和“化学效应”（极性、酸碱性、氢键亲和力等）组成，可以用Hildbrand溶度参数（）表示式中，a为分子间引力，
15、V为摩尔体积，为溶度参数，cal/cm3 或者 J/cm3各种流体的溶剂力与液体比较的分度表见图 13所示，由图 13可看出，超临界流体状态二氧化碳的溶剂力与异丙醇（45.22 J/cm3）、吡啶（44.80 J/cm3）相当，即相当于极性较强的溶剂，故可溶解并分析大部分非极性、中等极性样品，一氧化氮的溶剂力（44.38 J/cm3）与二氧化碳相似，当分离需要溶剂力更强的流动相时，可选用氨气（55.27 J/cm3），对于那些不能用二氧化碳来分离的碱性胺类物质，氨是很好的流动相，n-C4和n-C5是非极性流动相，分离非极性样品时选用。1.2.2 超临界流体色谱法的速率理论 实验发现，描叙流速对柱效影响的Van Deem特人方程和Golay方程仍适用。1. Golay速率理论毛细管SFC的速率理论模型与毛细管GC相同，其总塔板高度也是由分子扩散、流动相传质、固定相传质三相加和而成，经许多学者验证，Golay涂壁开管柱速率理论方程适合用于毛细管SFC，其方程为式中，Dm为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；Ds为溶质在流动相中的扩散系数，cm2/s；r为柱内径；df为固定相的液膜厚度，cm；u为流动相的线速度，cm/s；k为容量因子。该方程式指出了操作参数对柱效的影响，当Dm、Ds、k确定后，H-u曲线就成为双曲线，Golay方程可简化为式中，B/u为纵向扩散对塔板高
