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1、米心水青冈遗传多样性和遗传结构研究 摘要： 利用6对SSR引物对米心水青冈的25个居群的遗传多样性及遗传结构进行了检测分析，结果表明，米心水青冈的遗传多样性（Na= 47，He=0.576）偏低，供试居群的基因分化系数Fst 平均为0.1385，表明14%的遗传变异存在于居群间，而86%的遗传变异存在于居群内。居群间遗传一致度变化范围为0.06560.7420，且居群地理距离越远，遗传距离就越大。本研究为水青冈品种遗传多样性的评价和采用合理的保护策略提供了科学依据。关键词：水青冈；遗传多样性；遗传结构；SSR Genetic diversity and genetic structure of
2、 Fagus engleriana Seem.( Fagaceae)Abstract: Genetic diversity and genetic structure of 25 populations of Fagus engleriana Seem. were studied by using 6 microsatellite loci. he results revealed a low degree of genetic diversity (Number of different alleles, Na was 4. 7. He was0.576).The genetic diffe
3、rentiation (Fst=0.1385)suggested that 14% genetic variation existed among populations ,meaning that 86%genetic variationhappened among the individuals within populations.the cluster analysis showed that genetic identity(0.0656 to0.7420 ) among populations was negatively correlated with the geographi
4、cal distance ,consistent with the isdation by distance model for the isolation populations. The results are useful for providing scientific basis for the assessment for genetic diversity and appropriate conservation strategies of Fagus engleriana.Key words ：Fagus engleriana；Genetic diversity；Genetic
5、 structure；SSR近年来，SSR作为分子标记所具有的优点使其在植物遗传图谱构建及基因或QTL的定位、物种进化与分类、品种遗传多样性、品种保护与亲子鉴定、纯度鉴定、杂种优势的机理及其预测等方面得到广泛应用1。与RAPD技术及AFLP技术相比，微卫星技术在分析遗传多样性方面更具有优势，现已被广泛应用于农作物2、畜牧3等的分析中。分析过去的历史和现在的过程（如漂变、扩散、交配和选择、居群大小，基因流），分子标记对居群遗传结构是最具价值的4。欧洲、日本、美国等国家已经对它们的水青冈属植物遗传多样性做了大量工作，我国虽然水青冈的种类丰富，但利用DNA分子标记对水青冈属植物遗传多样性的研究不是很
6、多。水青冈属植物是北半球亚热带山地落叶阔叶林和常绿落叶阔叶混交林的重要建群种5，米心水青冈在我国北起秦岭南坡，南至贵州梵净山，西起四川二郎山，东至于浙江天目山。米心水青冈分布虽然广，但目前多呈现单株散生于山地阔叶林中，仅在四川大巴山南坡、湖北西部神农架地区、安徽南部的黄山和浙江的天目山等地区有小片分布。米心水青冈分布于800-2200m的林中，其林分布上呈现自西向东，由南向北递减的特点。其分布状况在我国水青冈属植物中具有典型性，本文利用SSR分子标记分析研究米心水青冈的遗传多样性和遗传结构，为米心水青冈天然种质资源的保护，可持续利用和遗传改良提供科学依据。1. 材料和方法1.1材料本文根据米心
7、水青冈的分布特点，在安徽、浙江、湖北、湖南、四川、重庆、陕西、甘肃、广西、云南10个省市（自治区）进行野外标本采集，共获得米心水青冈25个居群526份样本1.2 DNA的提取及检测 取硅胶干燥的叶片，用CTAB6法提取DNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外分析仪上观察拍照。DNA主带清晰、无弥散带、RNA去除干净则认为DNA质量较高。1.3 SSR引物从四篇文献中筛选引物：日本波叶水青冈（F. crenata）9对引物7，欧洲水青冈（F. sylvatica）6对引物8，日本波叶水青冈（F. crenata）16对引物9，长柄水青冈（F. longipetiolata）11对引物10。总共
8、52对引物进行筛选。表1-2 不同SSR位点的相关遗传参数Table 3-2 Parameters for different SSR lociLocusPrimer sequences（5-3）Repeat motifTa（）Size range（bp）sfc0036F: CATGCTTGACTGACTGTAAGTTC(TC)236096-142R: TCCAGGCCTAAAAACATTTATAGsfc0305CCAATGGACTTGTTATACCAATC(GA) 2460159-203GCACCAGTTGCTTACAGAATAGsfc1143TGGCATCCTACTGTAATTTGAC(A
9、G) 216096-136ATTCCACCCACCATCTGTCFl05GGCACATTACACCTAAATA(TC) 1259153-189GCATAATAAAGAGAGGAGACFl15TCTTTCATACTCATATCATCTAC(AG)1259137-179TGTCCTTATCTCTGGAACTTsfc0195-2CCAGCCTCTCGTCTATTATC(TC) 755175-187AATGGAATGCTTGTTCAAC1.4 PCR反应 PCR总反应体系：将提取的DNA的浓度稀释10倍，扩增反应体系为20L。具体如下：ddH2O 11.8L；10PCR Buffer 2L；1.6MM
10、gCl2 2L；0.2MdNTP 2L；Forward primer（0.2M）0.5L；Reverse primer（0.2M）0.5L；1.5单位Taq polymerase 0.2L；DNA模版（Template DNA）1L。部分材料采用Mix方法，扩增反应体系为24L。具体数据如下：ddH2O 8.5L；TIANGEN2Taq PCR Mastermix 12.5L；Forward primer（0.2M）1L；Reverse primer（0.2M）1L；DNA模版（Template DNA）1LPCR应用程序为：94，4min；94，45s；退火：45s；72，45s；30个循环
11、；725min；退火温度根据引物不同而有所差异5560，扩增反应后45min后取出至于4的冰箱待用。1.5电泳及银染采用6%聚丙烯酰胺凝胶（按100mL加500L10%的过硫酸氨和100L的TEMED的比例加入），1TBE的电泳缓冲液，功率55W预电泳30min左右，0.1%的硝酸银染色。胶晾干后观察记录拍照。1.6数据处理将原始数据整理成基因数据后，用软件GenAlEx6.0分析计算各居群的样本量（N）、观察等位基因数目（Na）、有效等位基因数目（Ne）、Shannon多样性指数（H）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、无偏期望杂合度（UHe）及居群类固定指数（F）等遗传多样性参数。并
12、运用各位点的F统计量采用POPGENE1.32计算近交指数（Fis），基因分化系数（Fst），基因流（Nm）及Neis遗传距离。采用MEGA软件通过UPGMA方法（非加权组平均法，Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic means）绘制个体间以及居群间的UPGMA遗传聚类图来反映居群间关系。2结果与分析2.1遗传多样性和遗传结构供试群体的遗传多样性参数计算结果如下表2-1, 对25个种群进行统计，平均观察等位基因数目从2.3到6.5（平均值为4.7，最低四川峨眉，最高陕西镇巴）。平均有效等位基因数目从1.9到3.8（平均值为3.0，最低四川峨眉
13、，最高四川南江魏家坝）。Shannon多样性指数方面，最小值为四川峨眉（0.657），最大值为四川南江魏家坝（1.377），平均值为1. 126。观察杂合度方面最小值为四川都江堰0.318，最大值为安徽舒城0.542，平均值0.426。期望杂合度最小值为四川峨眉（0.401），最大值为四川南江桃源（0.685），平均值为0.576。无偏期望杂合度的值都比期望杂合度的值大，数值大小排列和期望杂合度差不多。无偏期望杂合度值最小值为四川峨眉（0.458），最大值为四川南江桃源（0.702），第二大值为四川南江魏家坝（0.689），平均值为0. 594。固定指数F最高值为0.416，为重庆奉节FJ居群
14、。最低值为0.033，为安徽舒城SC居群。表2-1 不同居群的相关遗传参数Table 2-1 Parameters for different populations居群Pop样本量N观察等位基因数Na有效等位基因数NeShannon多样性指数H观察杂合度Ho期望杂合度He无偏期望杂合度UHe固定指数F重庆巫溪文峰WF225. 3332. 9991. 1750. 4290. 5880. 6020. 250*重庆奉节FJ19. 0005. 0003. 2601. 1830. 3190. 5840. 6000. 416甘肃文县WX22. 6674. 3332. 8531. 0400. 3660.
15、5410. 5540. 345*安徽岳西YX18. 6674. 6672. 9681. 0590. 3910. 5260. 5410. 256*四川旺苍WC23. 0005. 0002. 8261. 1390. 4780. 5740. 5870. 202*甘肃康县KX21. 0004. 5002. 6031. 0490. 3890. 5440. 5580. 255重庆巫溪鱼鳞YL23. 0004. 5002. 7501. 0530. 4350. 5450. 5570. 199湖北宜昌YC19. 6674. 8332. 5931. 0560. 4310. 5390. 5540. 206安徽舒城SC44. 0003. 0002. 3560. 8820. 5420. 5050. 5770. 033#
