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1、第二节 真核生物基因组DNA序列的复杂度一、重复序列的检测真核生物基因组DNA C值的巨大差异提出了一个重要的问题，是否C值愈大的物种就含有更多的基因？还是基因数目并未增加而是含有大量不编码蛋白质的重复序列DNA？如果是基因数目随着C值大小而增加，那么编码这些结构基因的单一DNA序列的数量也应随之增加，相反如基因组中DNA含大量不编码的重复序列，那么基因的数目就不一定与C值成比例增加。为此可通过复性动力学来检测基因组DNA序列的复杂性（sequence complesity of DNA poputation）。也就是通过DNA的变性（denaturation）和复性（renaturation
2、）反应的动力学过程分析DNA序列的性质，由于复性的速率取决于互补的DNA序列之间的随机碰撞， 所以DNA复性是一个双分子二级反应。单链消失速度其中：C为单链DNA的浓度（单位是每升的核苷酸摩尔数）；t为时间（单位为s）；k为重组速率常数（单位是Lmols），k取决于阳离子浓度、温度、片段大小和DNA序列的复杂性。当t=0时，CC0，表明所有DNA都是单链，C0为DNA总浓度。复性的分数CC0是起始浓度和经过时间的乘积C0t的函数，这样的函数绘成图称为C0t曲线（图7-3）。从方程式可见控制复性反应的参数是C0t，如当tt1/2时，即如果基因组中每一种基因只有一个，即都是单拷贝序列，那么基因组愈
3、大则基因组的复杂性愈大，复性速率愈小，k也愈小，所以C0t1/2与非重复序列的基因组大小呈正比。即图6-3表明，C0t1/2与基因组的大小成正比。其中polyUpolyA，其kC0t1/2=1个核苷酸对，因而复性最快；MS2是RNA噬菌体，T4为DNA噬菌体，每个基因组的大小用箭头标于图的上方。二、DNA序列的类别不同生物基因组的C0t1/2是不相同的，C0t1/2的位置除了决定于基因组的大小以外，还取决于每个基因的核苷酸序列的重复次数，重复次数愈少则复性愈慢，C0t1/2的位置愈后，重复次数愈多，C0t1/2位置愈前。真核生物基因组的复性曲线往往出现两个或3个明显不同的C0t1/2位置，说明
4、这类基因组中包含着重复次数显然不同的几个成分（图7-4），该图是假设的一个真核生物基因组复性曲线。从上图可以看出，最后复性这部分DNA的C0t1/2630，它占全部DNA的45，相当于3.0108bp，重复频率为1；中间这部分DNA的C0t1/2=1.4，占全部DNA的30，相当于60105bp，该DNA序列重复频率为350；复性最快部分DNA的C0t1/20.0013，占基因组DNA的25，相当于340bp，重复频率为5105。显然第一部分，即复性最慢的部分是单拷贝DNA序列，第二部分为少量重复或中度重复DNA序列，第三部分为高度重复DNA序列。因此真核生物基因组序列大致可分为许多类型。 （
5、一）单拷贝序列（unique sequence）亦称非重复序列（nonrepetitive sequence）在一个基因组中只有一个拷贝或2-3个拷贝。真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。不同生物基因组中单拷贝序列所占的比例是不同的（图7-5）。原核生物中一般只含有非重复序列，较低等的真核生物中大部分DNA也是单拷贝的。动物细胞基因组中将近50DNA是中度或高度重复的，特别是植物和两栖类生物中单拷贝DNA序列降低，而中度和高度重复序列增加。从图中还可看出，随着生物的基因组大小的增加，非重复DNA片段长度也随之增加，通常单拷贝序列比较短，只有1000bp左右，故所占的DNA的百分比也很低
6、。两栖类和植物基因组C值的增加并非是单拷贝序列的增加，而是重复序列DNA比例的增加。非重复DNA很少达到2109bp的。由此可见，非重复DNA含量和生物的相对复杂程度是一致的。而且大多数结构基因是位于基因组的非重复DNA序列之中。单拷贝的基因编码许多重要的蛋白质，例如，丝心蛋白单拷贝基因能够合成高达104的mRNA分子，每个mRNA分子又可合成出105个蛋白质分子，这充说明单拷贝基因的高度表达能力。当然也不是所有的单拷贝序列都是编码多肽链的结构基因，因为真核生物基因组中编码的序列不过只有百分之几。（二）中度重复序列（moderately repetitive sequence）中度重复序列中的
7、重复单位平均长度约300bp，重复次数为10102，人的珠蛋白（红血蛋白）基因属于这种少量重复序列，人的珠蛋白基因中除了包括已确定的8个珠蛋白功能基因和3个珠蛋白假基因外，还有一个近年发现的基因。假基因也属于少量重复序列。另一类中度重复序列的重复次数为103105，该序列常以回文序列方式出现在基因组的许多位置上，一些回文序列中间间隔着单拷贝序列，另一些中间不存在单拷贝序列，所以经变性复性后，前者可观察到茎-环结构，后者则形成发夹图像（图7-6）。中度重复序列一般是不编码的序列，这种重复序列和非重复序列一样都不是一个长序列，它们都要被其他组分所隔断。（三）高度重复序列（highly repeti
8、tive sequence）顾名思义，高度重复序列就是在基因组中存在大量拷贝的序列，一般重复次数在106以上。通常这些序列的长度为6200bp，如卫星DNA。这些重复序列大部分集中在异染色质区，特别是在着丝粒和端粒附近。高度重复序列中常有一些AT含量很高的简单串联重复序列。因序列简单，缺乏转录所必需的启动子，故没有转录能力。然而DNA复制能力却和单一序列复制得一样快。大多数高等真核生物DNA都有20以上的高度重复序列，而且数目变化很大，这类序列的多少对C值的影响可能最大。一般认为大多数重复序列是过剩的DNA，但其中某些重复序列具有特殊的功能，如调节基因的表达，增强同源染色体之间的配对和重组，维
9、持染色体结构的稳定性，调节mRNA前体的加工过程，参与DNA复制等，此外重复序列还可能是进化的源泉之一。但是，重复序列的确切生物学意义尚有待阐明。三、卫星DNA卫星DNA（satellite DNA）是一类高度重复的DNA序列。各种DNA在氯化铯梯度离心中，平衡时的浮力密度决定于它的GC含量，GC含量越高，浮力密度越大。真核生物的DNA一般含有3050GC含量，在DNA的不同区段，GC含量约相差10。对一个物种来说，当基因组DNA切断成数百个碱基对的片段进行超离心时，其浮力密度曲线是覆盖一定浮力密度范围的一条宽带，但是有些DNA片段都含有异常高或低的GC含量，常在主要DNA带的前面或后面有一个
10、次要的DNA带相伴随，这些小的区带就像卫星一样围绕着DNA主带，故称卫星DNA。有的高度重复序列的碱基组成与基因组DNA总体的碱基组成差异不大，接近于平均值，因而并非所有的高度重复序列都能形成卫星DNA。复性动力学鉴定发现高度重复的DNA与卫星DNA一样，具有串联集中分布的特点。因此有时把这种高度重复序列称为隐蔽卫星DNA（cryptic satellite DNA）。卫星DNA的重复单位长短不一，牛的卫星DNA是1400bp，某些猴的卫星DNA是172bp，蟹的卫星DNA大部分是AT的重复序列，有时在30个左右的碱基对中才偶尔插入一个GC对，因而AT含量达到97。果蝇（Dvirilis）有3
11、条卫星DNA区带，也是多为AT对，并且还有一个隐蔽卫星（表7-2）。Miklos 1985年的研究指出，果蝇Dnasutoides基因组的60由卫星DNA构成，而它们全部都处在4对染色体的一对最大的染色体上，而这对染色体看来几乎不含别的DNA。根据卫星DNA的浮力密度可以分成、4类，它们的浮力密度分别是1.687、1.693、1.647和1.700gcm3。卫星DNA在染色体上的位置可以用放射性标记探针作DNA分子原位杂交（in situ hybri dization）来鉴定，发现4类卫星DNA都能与人的各条染色体杂交，而且杂交的带型也很相似。说明这4类卫星DNA也存在于人的染色体上，而且分布
12、的状况也相同。卫星DNA分布于着丝粒附近的异染色质区。由于异染色质区是高度螺旋化的，DNA是不表达的。卫星DNA在着丝粒处的集中分布可能与细胞分裂时染色体的运动有关。哺乳动物的卫星DNA常常是多等级的，即一个大的重复单位是由若干个彼此相似的小重复单位串联组成，每个小重复单位又由若干个彼此相似的更小的重复单位串联组成。如小鼠卫星DNA用限制性内切酶EcoR切割，得到234240bp的一系列片段，序列分析发现其中234bp的带在6070的卫星DNA里都有这种序列。若将234bp的左、右各一半的各117bp排列起来进行比较，发现只有22个bp不同，差异为19。说明234bp的重复单位是由117bp亚
13、重复单位重复而来，由于突变而积累了差异。117bp的亚单位又可分成两个58bp的14亚单位。4个58bp亚单位之间的差异达到40。58bp的亚单位又可分成两个18的亚单位，其中之一是28bp（亚单位），另一部分是30bp（亚单位）。8个18亚单位之间的差异达61。如果再将18亚单位分成3个部分，每一部分都含有GAAAAACGT、GAAAAATGA、GAAAAAACT近似序列。由此推测小鼠的234bp高度重复序列可能是由一个9bp的祖先序列例如GAAAAATGT演化而来的。其演化原理可能是在某特定时刻由于某种原因使一个DNA序列横向扩增产生多个串联重复单位，经92758117234bp4轮的横向
14、扩增和突变积累过程，在这个过程中，使不同的重复单位失去同一性，也可能产生插入突变，致使现在的234bp的重复序列也并不完全相同。一般说卫星DNA不受任何选择压的影响，因为它不编码蛋白质或RNA，因而小鼠卫星DNA各个拷贝的序列有相似性而不完全相同。然而有些卫星DNA如节肢动物的卫星DNA是由几乎相同的重复单位组成的。值得注意的是在人的第17号染色体上串联分布的U2snRNA基因有1020个拷贝。每个重复单位约6000bp，而其编码序列却只有188bp。选择压作用于编码序列而使其保持相同，这是不言而喻的。难以理解的是其余5800bp的间隔序列为什么也会保持相同？虽然其中有100bp左右的转录起始、终止以及转录后处理的信号，它们必须是保守的。对其剩余的5700bp的保守性形成的机制以及上述节肢动物卫星DNA的实例中，人们认为：任何串联重复的DNA序列，不论其中是否含有编码的遗传信息，都将经受均一化作用（homogenization），使串联重复的DNA序列保持均一化。一般认为有两种机制：一是交换固定（crossover fixation），二是基因转变（gene conversion）。这两种机制与基因扩增一道维持了串联重复序列的均一化。
