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1、精选文档人用重组DNA制质量量控制技术指导原则一、前言因为分子遗传学、核酸化学及重组DNA（rDNA）技术的迅速发展，现已可以确定和获取很多天然活性蛋白的编码基因，将其插入表达载体或引入某种宿主细胞后，能有效地表达该基因产物，再经分别、纯化和检定，可获取用于预防和治疗某些人类疾病的制品，诸如现有的乙型肝炎疫苗、胰岛素、生长激素、搅乱素等。用不一样于惯例方法的rDNA技术生产的制品，是最近几年来出现的新产品，议论其安全性和有效性亦不一样于惯例方法。这一领域中的知识和技术还在不停发展，为了有益于这种制品在我国的研究和发展，并为这种制品的审评供给依照，有必需拟定一个原则性指导文件，以保证在人群中试验
2、或应用时安全有效。本“人用重组DNA制质量量控制技术指导原则”（以下简称指导原则）不行能左右逢源，可能有很多特地技术问题会出现，关于这种问题或某一特定制品，则应视详细问题详细研究决定。本指导原则亦将随科学技术发展和经验累积而逐渐完美。二、总则（一）本指导原则合用于rDNA技术生产并在人体内应用的蛋白质、肽类制品。（二）凡属与一般生物制品相关的质量控制，均按现行版中国药典相关规定履行。相关生产设备的要求应参照国家药品督查管理局药品生产质量管理规范履行。三、质量控制要求（一）原资料的控制表达载体和宿主细胞应供给相关表达载体详细资料，包含基因的本源、克隆和判定，表达载体的成立、结构和遗传特征。应说明
3、载体构成各部分的本源和功能，如复制子和启动子本源，或抗生素抗性标记物。供给最少包含成立中所用位点的酶切图谱。应供给宿主细胞的资料，包含细胞株（系）名称、本源、传代历史、检定结果及基本生物学特征等。应详细说明载体引入宿主细胞的方法及载体在宿主细胞内的状态（能否整合到染色体内）及拷贝数。应供给宿主和载体联合后的遗传稳固性资料。克隆基因的序列应供给插入基因和表达载体双侧端控制区的核苷酸序列。所有与表达有关的序列均应详细表达。表达应详细表达在生产过程中，启动和控制克隆基因在宿主细胞中的表达所采纳的方法及表达水平。4原辅料原辅料应依照国家药品督查管理局相关规定履行。动物源性原料的使用应供给本源及质控检测
4、资料；发酵用培育基不可以增添内酰胺类抗生素。（二）生产的控制1主细胞库（MASTERCELLBANK）rDNA制品的生产应采纳种子批（SEEDLOT）系统。从已成立的主细胞库中，再进一步成立生产细胞库（WCB）。含表达载体的宿主细胞应经过克隆而成立主细胞库。在此过程中，在同一实验室工作区内，不得同时操作两种不一样细胞（菌种）；一个工作人员亦不得同时操作两种不一样细胞或菌种。应详细记述种子资料的本源、方式、保留及估计使用寿命。应供给在保存和复苏条件下宿主载体表达系统的稳固性凭据。采纳新的种子批时，应重新作全面检定。真核细胞用于生产时，细胞的鉴识标记，如特异性同功酶或免疫学或遗传学特色，对鉴识所成
5、立的种子是实用的。相关所用传代细胞的致癌性应有详细报告。如采纳微生物培育物为种子，则应表达其特异表型特色。一般状况下，在原始种子阶段应确证克隆基因的DNA序列。但在某些情况下，比方传代细胞基因组中插入多拷贝基因。在此阶段不适合对克隆基因作DNA序列解析。在此状况下，可采纳总细胞DNA的杂交印染解析，或作mRNA的序列解析。对最后产品的特色判定应特别注意。种子批不该含有外源致癌因子，不该含有传染性外源因子，如细菌、支原体、真菌及病毒。有些细胞株含有某些内源病毒，比方逆转录病毒，且不易除去。但当已确知在原始细胞库或载体部分中污染此类特定内源因子时，则应能证明在生产纯化过程可使之灭活或除去。有限代次
6、生产用于培育和引诱基因产物的资料和方法应有详细资料。对培育过程及收获时，应有敏感的检测措施控制微生物污染。应供给培育生长浓度和产量恒定性方面的数据，并应确定荒弃一批培育物的指标。依据宿主细胞载系统统的稳固性资料，确定在生产过程中同意的最高细胞倍增数或传代代次，并应供给最适培育条件的详细资料。在生产周期结束时，应监测宿主细胞载系统统的特征，比方质粒拷贝数、宿主细胞中表达载体存留程度、含插入基因的载体的酶切图谱。一般状况下，用来自一个原始细胞库的全量培育物进行监测，必需时应做一次目的基因的核苷酸序列解析。连续培育生产基本要求同2项。应供给经长久培育后所表达基因的分子完好性资料，以及宿主细胞的表型和
7、基因型特色。每批培育的产量变化应在规定范围内。对可以进行后办理及应荒弃的培育物，应确定指标。从培育开始至收获，应有敏感的检查微生物污染的措施。依据宿主载体稳固性及表达产物的恒定性资料，应规定连续培育的时间。如属长时间连续培育，应依据宿主载体稳固性及产物特征的资料，在不一样间隔时间作全面检定。纯化关于收获、分别和纯化的方法应详细记述，应特别注意污得病毒、核酸以及有害抗原性物质的去除。如采纳亲和层析技术，比方用单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不该含有可测出的异种免疫球蛋白。对整个纯化工艺应进行全面研究，包含可以去除宿主细胞蛋白、核酸、糖、病毒或其余杂质以及在纯化过程中加入的有害的
8、化学物质等。关于纯度的要求可视制品的用途和用法而确定，比方，仅使用一次或需频频多次使用；用于健康人群或用于重症患者；对纯度可有不一样程度要求。（三）最后产品的控制应成立相关产品的鉴识、纯度、稳固性和活性等方面的试验方法。检测的必需性和纯度要求取决于多种要素：产品性质和用途、生产和纯化工艺及生产工艺的经验。一般说来以下试验对控制产质量量是可以采纳的。新的解析技术及对现有技术的改进正在不停进行，适合时应使用这些新的技术。物理化学判定（1）氨基酸构成使用各种水解法和解析手段测定氨基酸的构成，并与目的蛋白基因序列推导的氨基酸构成或天然异构体比较。如需要时应试虑分子量的大小。多数状况下，氨基酸构成解析对
9、肽段和小蛋白可供给有价值的结构资料，但对大蛋白一般意义较小。在多数状况下，氨基酸定量解析数据可用于确定蛋白含量。（2）氨基酸尾端序列氨基酸尾端解析用于鉴识N-端和C-端氨基酸的性质和同质性。若发现目的产品的尾端氨基酸发生改变时，应使用适合的解析手段判断变异体的相应变异数目。应将这些氨基酸尾端序列与来自目的产品基因序列推导的氨基酸尾端序列进行比较。（3）肽谱应用适合的酶或化学试剂使所选的产品片段产生不连续多肽，应用HPLC或其余适合的方法解析该多肽片段。应尽量应用氨基酸构成解析技术，N-尾端测序或质谱法鉴识多肽片段。对批签发来说,经考据的肽谱解析常常是确证目的产品结构/鉴其余适合方法。（4）巯基
10、和二硫键假如依照目的产品基因序列存在半胱氨酸残基时，应尽可能确定巯基和/或二硫键的数目和地点。使用方法包含肽谱解析（还原和非还原条件下）、质谱测定法或其余适合的方法。（5）碳水化合物结构应测定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。其余尽可能解析碳水化合物的结构、寡糖形态（长链状）和多肽的糖基化位点。（6）分子量应用分子筛层析法、SDS-PAGE（还原和/或非还原条件下）、质谱测定法、和/或其余适合技术测定分子量。（7）等电点经过等电聚焦电泳或其余适合的方法测定。（8）消光系数（或克分子吸光度）多数状况下，可取目的产品于UV/可见光波优点测定消光系数（或克分子吸光度）。消光系数的测定
11、为使用UV/可见光或分光光度计检测已知蛋白含量的溶液，蛋白含量应用氨基酸构成解析技术或定氮法等方法测定。（9）电泳图型应用PAGE电泳、等电聚焦、SDSPAGE电泳、免疫印迹、毛细管电泳法或其余适合的方法,获取目的产品/药物的一致性,同一性和纯度的电泳图谱和数据。（10）液相层析图谱应用分子筛层析、反相液相层析、离子交换液相层析、亲和层析或其余适合方法，获取目的产品/药物的一致性、同一性和纯度的层析图谱和数据。（11）光谱解析适合时，应用紫外或可见光汲取光谱法测定，使用圆二色谱、核磁共振NMR）、或其余适合的方法检测制品的高级结构。2杂质检测（1）工艺相关杂质工艺相关杂质本源于生产工艺，可分三
12、大类：本源于细胞基质、培育基和下游工艺。本源于细胞基质的杂质包含源于宿主生物体的蛋白/多肽；核酸（宿主细胞/载体/总DNA）；多糖及病毒。关于宿主细胞蛋白，一般应用能检测出较宽范围蛋白杂质的敏捷的免疫检测方法。应用不含目的基因的生物体粗提物，即不含产品编码基因的生产用细胞，制备上述试验使用的多克隆抗体。可经过对产品的直接解析方法（如杂交技术法）检测宿主细胞的DNA水平，和/或经过标记实验（实验室规模）检测证明经过纯化工艺能去除核酸。关于有意导入的病毒，应考据生产工艺中去除/灭活病毒的能力。本源于培育基的杂质包含引诱剂（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其余培育基组分。本源于下游工艺产生的杂质包含
13、酶、化学/生化办理试剂（如溴化氰、胍、氧化剂和还原剂）、无机盐（如重金属、砷、非有色金属离子）、溶剂、载体/配体（如单克隆抗体），及其余可滤过的物质。（2）产品相关杂质以下为最常有的目的产品的分子变异体，并列出了相应的检测方法：化学修饰种类：应试虑脱酰胺、异构化、错配S-S连接和氧化形式的分别和鉴识。对这些变异体的分别和鉴识，可应用层析法和/或电泳法（如HPLC、毛细管电泳、质谱法、圆二色谱）。降解物和聚合体：聚合体包含二聚体和多聚体：可用分子筛层析法（如SE-HPLC）进行定量；降解物：应成立降解物的判断标准，并对稳固性试验产生的降解产物进行监测。生物学测定（1）鉴识试验应用免疫印迹法，或许
14、在可能状况下，应用参照品将rDNA制品与天然产品经过生物学比较试验，确定其与天然产品是一致的。（2）效价测定采纳国际或国家参照品，或经过国家检定机构认同的参照品，以体内或体外法测定制品的生物学活性，并注明其活性单位。（3）特异比活性测定在测定生物学活性的基础上，对有些制品还应用适合方法测定主药蛋白含量，测定其特异比活性，以活性单位重量表示。（4）热原质试验应采纳家兔法或鲎试验法（LAL）作热原质检测，控制标准可参照天然制品的要求。（5）无菌试验参照现行版中国药典相关规定进行，应证明最后制品无细菌污染。（6）抗原性物质检查必需时，如制品属大剂量频频使用者，应测定最后制品中可能存在的抗原性物质，如
15、宿主细胞、亚细胞组分及培育基成份等。患者频频接受大剂量的这类制品时，应亲近监测由这些抗原可能产生的抗体或变态反应。（7）异样毒性试验可参照现行版中国药典相关规定进行。其余依据产品剂型，应有外观（如固体、液体、色彩、澄明度等方面的描述）、水分、PH值、装量等方面的规定，可参照现行版中国药典相关规定履行。四、临床前安全性议论临床前安全性试验的目的主若是确定新制品能否会在人体惹起未能料想的不良反应。但是，用于一般化学药物的传统安全性或毒性试验对rDNA产品不必定合用，用传统毒性试验来议论rDNA产品常常有困难，并受多种要素的影响。比方，某些蛋白质，如搅乱素，拥有高度种属特异性，这种人的蛋白质对人的药理学活性远高于对动物的活性，并且人的蛋白质氨基酸序列，常常与来自其余种系的蛋白质不一样，比方糖基就不一样样。因此由基因工程技术所制备的蛋白质或肽类常常会在人体以外的其余宿主中产生免疫应答，其生物学效应有所改变，并可能因形成免疫复合物而以致有毒性反应，而这样产生的毒性反应与人体安全性明显没关。别的，因为产品效价、生产工艺或许产品稳固性等要求，对产品进行修饰或许改构，应供给与未修饰或许改构产品比较的研究资料。以简化生产工艺为目的在产品中引入的额外多肽片段如His-tag，在最后产品中应尽可能去除。综上所述，对rDNA产品的临床前安全性试验要求，难以混作一谈，应采纳较为灵巧的
