《单链抗体的研究进展与展望.doc》由会员分享，可在线阅读，更多相关《单链抗体的研究进展与展望.doc（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、微囊藻毒素微囊藻毒素是富营养化的淡水水体中常见的藻类毒素，它是一类具有蛋白磷酸酶抑制和强烈致肝癌作用的环状七肽。目前已经报道的微囊藻毒素已有 70 多种，其中微囊藻毒素 LR 是（microcystin LR, MC-LR）已知毒性最强、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素。以基因工程抗体技术的主流形式噬菌体展示技术为例，目前利用噬菌体展示技术，筛选制备 MC-LR 的单链抗体或多肽配体的研究，已有少量报道。从鼠源合成噬菌体抗体库中，快速分离获得微囊藻毒素 LR 单链抗体【1】另外，由于单链抗体具有大规模、均一化生产等优点，有潜力应用于微囊藻毒素 LR 的免疫学检测或免疫亲和柱的制备，同时也探索了一
2、种高效的微囊藻毒素 LR 单链抗体的库筛选、鉴定方法。文献：【1】【基于磁珠和时间分辨荧光免疫分析的微囊藻毒素 LR单链抗体筛选与鉴定】刘 媛1, Huovinen Tuomas2，刘贤金1，梁 颖1，张存政1，谢雅晶1,贺 江1，王 耘1, 张 霄1（1江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所，中国南京 200014；2芬兰图尔库大学生物系，芬兰图尔库 20520河豚毒素 河豚毒素（TTX）是一种小分子量的、胍盐神经毒素它存在于河豚、蝾螈、斑足蟾等动物中的海洋毒素。它主要通过抑制神经或肌肉组织的钠离子（Na+）电压门控通道起作用，从而导致神经麻痹、呼吸困难甚至是死亡。但是到目前为止，针对河豚
3、毒素的有效的、快速灵敏的检测方法还没有出现，而发展针对河豚毒素的免疫学方面的检测方法是非常有必要的。抗河豚毒素的基因工程单链抗体的制备首先通过一种化学方法（曼尼希反应）来制备了河豚毒素的完全人工抗原（TTX-BSA：作为检测用抗原；TTX-KLH：作为免疫用抗原），并且采用了小量的、重复的免疫方式，实验组总共免疫了3只Balb/c小鼠。从免疫好的小鼠的脾脏中提取其全RNA，并反转录合成cDNA的第一条链，以此作为模板通过常规的PCR反应扩增了抗体的重、轻链的可变区基因（VH和VL），配以适当分子数的Linker（G4S）3），通过重叠延伸PCR组装成了一个可以无限制编码抗河豚毒素（TTX）的重
4、组的单链抗体（scFv）基因。通过噬菌体展示技术，构建了一个依托于噬菌体质粒载体pCANTAB-5E的噬菌体展示文库。在经过辅助噬菌体M13KO7的再感染后，单链抗体就会展示在噬菌体的表面，然后再经过六轮的淘选过程，我们获得了可以和河豚毒素（TTX）特异性结合的抗体，并通过间接ELISA对其进行了定量的分析，选定其中的一株亲和力最高的单克隆（scFv-T53）进行了单链抗体的可溶性表达和各方面性质的分析研究，通过间接ELISA测定选定的单克隆的亲和力常数为1.1106L/mol。我们还通过生物信息学的手段，分析了scFv-T53的基因序列、氨基酸序列，预测了scFv-T53的可变区的划分、二级
5、结构、物理化学性质等。各种分析结果表面。本实验成功的从构建的噬菌体抗体库中筛选得到了特异的抗河豚毒素（TTX）的单链抗体。【2】文献：【2】抗河豚毒素的基因工程单链抗体的制备 刘立才1 单链抗体的特点单链抗体是一种新型重组蛋白,它是把抗体可变区重链(VH)与轻链(VL)通过一段约1525个氨基酸残基构成的弹性短肽(Linker)相连而成,这种连接可以是VH linker VL,也可以是VL link-er VH。单链抗体是具有亲代抗体全42部抗原结合特异性的最小功能结构单位,具有分子量小(仅为完整抗体的1/6)、对肿瘤的穿透力强、血流中半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达等特点。2 单链
6、抗体的研究进展2.1 单价单链抗体 1988年,Bird2和Huston3等最先研究成功单链抗体,他们用PCR技术从杂交瘤细胞的基因组DNA或其RNA反转录后的cDNA中扩增出VH和VL基因,用编码弹性短肽的寡核苷酸将两者连接起来,再将其插入原核细胞进行表达而获得,并发现在大肠杆菌中表达的单链抗体能自发折叠成天然构象,其抗原亲和性几乎与完整抗体相同。1990年,Challdhary等4成功地制备了绿脓杆菌外毒素单链抗体基因,其表达的免疫毒素可识别并杀死携带OVB3抗原的细胞。在其后的十几年时间里,研究人员进一步尝试用酵母或植物细胞进行表达并获得成功。2.2 单链抗体多聚体 与典型的抗体不同,单
7、价单链抗体只有一条轻链和一条重链,在与抗原结合方面还是稍逊于亲本抗体,因此,人们采用易于形成螺旋或折叠的多肽基因,使其与VH和VL基因在表达系统中共同表达,从而产生双价单链抗体。对连接VH和VL的Linker长度与单链抗体多聚体形成关系的研究认为5:如果选用由甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)组成长度为1525个氨基酸残基的Linker(序列为GGGGSGGGGSGGGGS),在折叠过程中,单链抗体的VH与VL功能区之间配对,形成单价单链抗体;如果Linker缩短为312个氨基酸残基,则同一单链抗体分子的VH与VL区就不能相互配对,而与不同单链抗体分子的VL与VH功能区配对成二价二聚体(即双价
8、单链抗体);如果Linker被进一步缩短为12个氨基酸残基,VH的C端残基就直接与VL的N端残基相连,两个单链抗体分子首先构成一个二价二聚体,两端游离的VH和VL再与第三个单链抗体分子构成三价三聚体。如果不使用Linker,则表达产物折叠后更易形成三价三聚体。2.3 双特异性单链抗体 人们发现,可以利用两种不同的单链抗体的VH和VL基因,使其在表达过程中实现重新组合,形成具有双特异性的单链抗体,这种双特异性单链抗体可以同时与两种抗原特异性地结合。与传统的双特异性抗体相比,双特异性单链抗体既保持了特异性结合抗原的特点又具有以下优点:缺失Fc片段,减少了与FcR阳性细胞发生非特异性结合的可能性;最
9、大限度地降低了鼠源性蛋白,降低了免疫变态反应的可能性;分子量小,有利于穿透肿瘤组织;避免了传统制备双特异性抗体需要进行细胞杂交的过程,减少了工作量,提高了制备的成功率。1993年Holliger等第一次成功地制备了双特异性单链抗体,目前已有十几株抗体制备成功。 单链抗体的不足与展望单链抗体技术经过了 20 多年的发展，取得了巨大的成就，但是在应用中仍然存在一些问题，如亲和力较低，稳定性较差，半衰期短等。（1） 单链抗体相对于其亲本单克隆抗体，亲和力低了 10-1000 倍，这成为它在免疫分析等应用中的一个制约因素，可以通过亲和力成熟对单链抗体的亲和力进行改进，或者通过构建多价抗体来增加抗体的功
10、能亲和性。（2） 单链抗体稳定性差，常常显示聚集倾向，尤其在 37时稳定性较差，可以引入二硫键模拟天然状态来稳定其结构，可使 VH 和 VL 形成稳定的异聚体 dsFv，再用相应载体系统进行构建。或者也可以将 ScFV 转化为 Fab 做进一步的分析。（3） 单链抗体分子质量小，体内清除速度快，有时候达不到治疗或诊断的时间。针对这一缺点，可以从多方面对 ScFv 进行改造，增加其抗原结合力，提高其亲和力，其中 ScFv 多聚体是其改进形式之一，是通过将ScFv 连接肽缩短至 12 个氨基酸以下构成的一种新型小分抗体，在体内应用时具有很多优势，克服了 ScFv 在体内清除过快的不足。但是，随着分子生物学、分子免疫学、单链抗体展示、表达技术研究的深入，获得各种目的的单链抗体指日可待。【3】【3】单链抗体的研究进展 秦海艳 毛晓燕 乔玉玲 李晓进 赵 红（兰州生物制品研究所 甘肃 兰州 730046）
