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1、cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。它是发现新基因和研究基因功能的工具。1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录
2、后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA谱，需要先构建cDNA文库。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：NcDNA文库所包含的克隆数目
3、； P低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99； 1/n每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：制备mRNA；合成cDNA；制备载体DNA；双链cDN的分子克隆；对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5端的序列。2.1mRNA的分离制备构建cDNA文库质量好坏的关键是制得高质量的mRNA。无处不在的mRNA酶极易降解mRNA，在mRNA的操作过程中自始至
4、终都必须防止RNA酶的降解作用。所有用于mRNA的实验的器皿都要高温焙烤或是用0.1焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）洗涤，所有试剂都要用DEPC处理过的水配制，DEPC是RNA酶的强变性剂，经煮沸DEPC即分解除去，避免残留物影响mRNA的实验；在破碎细胞的同时用强变性剂（如酚、胍盐等）使RNA酶失活；在mRNA反应中加RNA酶的抑制剂Rnasin。目前实验室中提取细胞总RNA的方法主要有：胍盐/氯化铯密度梯度超速离心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。前一方法常用于大量制备RNA；后一方法用于一般小量制备RNA，因此更为常用。真核生物的mRNA 3端通常都含有寡腺
5、苷酸poly(A),可以用寡聚胸苷酸oligo(dT)纤维素或琼脂糖亲和层析法来分离纯化。在高盐缓冲溶液中poly(A)RNA与oligo(dT)结合，低盐缓冲溶液使它们解离。2.2cDNA的合成合成cDNA的逆转录酶有两种，一种来自禽成髓细胞性白血病病毒（avian myeloblastosis virus,AMV），另一种来自莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney murine virus,M-MuLV）。逆转录酶为多功能酶，它能以RNA链为模板合成第一条cDNA链，并具有RNase H 活性，水解杂合分子中的RNA链，再以第一条cDNA链为模板合成第二条cDNA链。逆转录酶以4中dNTP为底
6、物，合成cDNA时需要引物，无校对功能。AMV逆转录酶反应的最适温度为42，最适pH8.3，并且具有较强的RNase H活性。M-MuLV逆转录酶由一条多肽链构成，反应最适温度为37，最适pH7.6，具有较弱的RNase H活性。第一条cDNA链的合成常用的引物为oligo(dT)1218，或是六核苷酸的随机引物（dN）6，如果序列是已知的，也可以用与mRNA3端序列互补的引物。杂合分子中的RNA链用RNase H或碱溶液水解除去。第二条cDNA链可用以下方法合成：回折法，利用第一条cDNA链自身回折来引发第二条链的合成，双链合成后用核酸酶S1(nuclease S1)切去回折处的单链DNA。
7、这一步操作常使cDNA失去5端的部分序列，因此现在较少使用。取代法，用RNase H部分水解DNA-RNA杂合分子中的RNA链，留下一些小片段RNA作为合成cDNA第二条链的引物，除加入DNA聚合酶和4种dNTP底物进行DNA合成外，还需加入大肠杆菌DNA连接酶和NAD+，使各片段连接。随机引物法，用六核苷酸在DNA链上随机引发合成第二条链。均聚物引发法（homopolymer priming），用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyltransferase,tdt），简称末端转移酶，加一种dNTP，在cDNA第一条链3端加上均聚物尾巴，然后用配对的寡聚物作为
8、引物合成第二条链。如果序列是已知的，也可用特异引物来合成第二条链。2.3双链cDNA的克隆用来克隆cDNA的载体主要为质粒和噬菌体载体。克隆的常用方法有：平端连接法，需先用Klenow酶或T4DNA聚合酶将双链cDNA两端填平补齐，然后用平末端与载体DNA连接，平端连接效率较低。cDNA两端加接头或衔接物，接头需用限制酶水解，因此加接头前cDNA应先用对应甲基化酶加以甲基化，以保护cDNA不被消化。用衔接物则无需使cDNA甲基化。二者都可使cDNA以黏性末端与载体DNA连接。均聚物加尾法，用末端转移酶在cDNA两条链的3端各加均聚（A）或均聚(G)，载体DNA的3端加配对的均聚（T）或均聚(C
9、)，当cDNA末端与载体DNA末端“退火”（annealing）后彼此“粘合”，即可用于转化宿主细胞。在几种改进的方法中可以将上述几步合并进行，例如，用衔接物与引物合在一起，当合成cDNA后即具有黏性末端，或者将引物加载载体DNA上，cDNA合成后直接连在载体上。3. cDNA文库构建方法进展最初的cDNA克隆技术主要适合于获得高丰度mRNA的拷贝，但对于低丰度mRNA的拷贝，通常需要筛选文库的大量克隆，才能获得相应的cDNA。有时既使筛选克隆的量很大也不能奏效。为了更有效地克隆到未知的低丰度mRNA的DNA，近年来已发展了一些cDNA文库构建的新方法和新技术。3.1 标准化cDNA文库标准化
10、cDNA文库又称为等量化cDNA文库，即某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且含量相等的cDNA文库这种文库主要有三方面的优点：第一，增加克隆低丰度mRNA的机会，适用于分析分化发育阶段的基因表达及突变检查；第二，等量化的cDNA可做探针来发现基因组序列中的转录区，尤其是普通探针所不能发现的稀有转录区；第三，与原始丰度的创mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与标准化的cDNA文库作杂交，可估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织表达特异的基因.基本方法：一种是用基因组DNA做选择杂交，所捕获的cDNA丰度与对应的基因组DNA丰度一致，其缺点是约20的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高，
11、另一种是根据cDNA退火的二级动力学特性，即稀有拷贝的cDNA较丰富拷贝的cDNA复性或杂交慢，使未复性部分的单链cDNA渐趋等化3.2 固相cDNA文库构建 1998年，Roeder开发了一种快速高效的cDNA文库构建方法。它基于传统的cDNA文库合成方法，包含通常所需的全部步骤。但在cDNA合成过程中引入了固相支持物。cDNA通过一个生物素基固定在链霉卵白素偶联的磁珠上，这样在反应中就可以简便而迅速的实现酶和缓冲液的更换，因此它将快速与高质量的文库结合在一起(构建文库只需一天)，并且构建的文库适合于大多数的研究目的。 该方法的关键步骤为：1)mRNA提取：使用一个修饰的5生物素化01igo
12、 dT（25）引物，5生物素GAGAGAGAGAGAGCGGCCGCT(25)GAC一3，其内部含一个NotI识别序列，通过5生物素连接在链霉卵白素包裹的磁珠上。mRNA通过与01igo dT引物互补，结合在磁珠上。2)第一链合成：A)如果cDNA合成以01igo dT引物进行，则mRNA不用低盐缓冲液洗脱，淋洗后直接进行第一链合成反应(加入酶、缓冲液等)。B)如果cDNA合成是以一个修饰的随机的寡核苷酸5生物素为引物，5生物素 一 GAGAGAGAGAGAGCGGCCGCNNNNNNN3，此引物与链霉卵白素包裹的磁珠结合。mRNA从01igo dT磁珠上洗脱后，加入到随机引物磁珠中，然后进行
13、第一链合成反应。 第二链生成，补平末端，加接头，激酶磷酸化等步骤的实现是通过吸去上清，并用下一步反应缓冲液冲洗来完成的。磷酸化是在固相上进行的最后一步酶反应。固相cDNA合成法的主要优点是可以简便cDNA合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有cDNA的丢失之忧，也无其他物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的代表性文库，它包含有短小的cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的cDNA合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量。3.3 差示cDNA文库差示文库又称为扣除文库，是反映不同组织和细胞或同一细胞在不同功能状态下，基因表达差异的c
14、DNA文库。主要用于研究细胞的发育、分化、细胞周期、细胞对药物和生长因子的诱导反应以及肿瘤等疾病的研究。基本流程：分别提取不同组织细胞或同一种细胞在不同功能状态下细胞的mRNA，将其中一种细胞的mRNA反转录成cDNA第一链，然后将该cDNA与另一细胞过量的mRNA进行杂交，第一种细胞中若存在不同于第二种细胞的特殊基因，则会产生特殊基因的mRNA和cDNA，它们不能与第二种细胞的mRNA形成杂交体。将未形成杂交体的cDNA分出，合成与之互补的cDNA第二链，再以此双链cDNA构建cDNA文库，即差示文库。传统一般利用羟基磷灰石柱层析的方法分离杂交单体，这种技术存在着操作复杂，周期长，核酸损失量
15、大等缺点赵大中等利用磁珠分离杂交单体缩短了实验周期，简化了实验程序，减少了杂交体的损失量，并且以一种mRNA为处理，两种mRNA为对照，进行消减杂交，可以扣除多一些的非特异基因，利于寻找更加特异的基因或基因片段，而且所建库容要比使用同种材料的传统方法所建库容大得多。3.4 抑制消减杂交抑制消减杂交是1996年Diatchenko等建立的一项以杂交和PCR为基础的基因克隆技术。该技术主要通过消减杂交将待比较双方共同的cDNA进行消减，再通过抑制PCR技术特异性地扩增在Tester中特异表达的cDNA片段，使其得到大量富集。 基本原理是：将两个群体的mRNA反转录为cDNA，其中含有特异性表达基因
16、的样本为Tester，另一组为Driver，先将T(Teqter)方与D(Driver)方用限制性内切酶切割为小片段，将T方平均分为两份，分别连接不同的接头，然后与过量的D方cDNA进行不充分杂交。根据复性动力学原理，浓度高的单链分子迅速复性，而浓度低的单链分子仍以单链形式存在。然后混合两份杂交样品，同时加入新的变性D方cDNA进行第二次扣除杂交，杂交完全后补平末端，加入合适的引物接头进行PCR扩增。当DNA两条链含相同接头时，其PCR扩增受抑制，而含不同接头的双链DNA分子才可进行指数扩增，其产物为目的片段。 SSH具有三大突出优点： (1)高度特异性，该技术经过两轮消减杂交及两步PCR，使Tester中代表差异表达基因的cDNA片段得到大量扩增，同时抑制了
